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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种高度传染性肠道疾病,给养殖业造成了严重的危害,现有的PEDV疫苗无法对PEDV变异毒株产生有效的防控作用,因此,从宿主的角度出发筛选猪抵御PEDV侵染的功能基因以及行之有效的分子标记,提高仔猪机体自身对PEDV的抵抗力,是防控PEDV侵染的最有效以及最根本的方法。miRNA是一种内源性非编码的单链RNA分子,长度约为18-23个核苷酸,可以与靶基因的3’非翻译区（3’UTR）结合从而调控其表达水平,与许多病毒侵染密切相关,可以作为潜在的分子标记物。目前miRNA对猪抵御PEDV侵染的调控作用及分子机制尚不清楚,因此筛选在猪抵御PEDV侵染过程中发挥的重要功能的miRNA及其靶基因,可以为进一步阐明PEDV致病机理提供理论依据,同时为筛选PEDV抗病育种潜在的分子标记物提供指导和依据。本研究对课题组前期获得的PEDV侵染引起肠道屏障受损的仔猪和健康的肠道屏障完整仔猪个体空肠黏膜进行miRNA测序,利用生物信息学筛选结合实验验证确定miR-129a-3p作为研究对象,从细胞水平分析验证miR-129a-3p调控PEDV侵染的功能,进一步从mRNA和蛋白水平鉴定miR-129a-3p靶向抑制EDA的mRNA稳定性,随后通过构建靶基因EDA过表达的猪小肠上皮细胞系（IPEC-J2）,对其在PEDV侵染中的功能机制进行了深入的验证,以期揭示miRNA在PEDV侵染宿主过程中的重要作用,为今后PEDV的抗病育种工作提供理论基础和依据。主要研究结果如下:1.miRNA测序筛选PEDV侵染仔猪过程中的重要候选miRNA为了筛选在PEDV侵染过程中发挥调控作用的重要候选miRNA,本研究对课题组前期获得的PEDV侵染引起肠道屏障受损的仔猪和健康的肠道屏障完整仔猪个体空肠黏膜进行miRNA测序,共筛选到57个差异表达的miRNA,其中PEDV侵染组表达上调的miRNA有25个,表达下调的miRNA有32个。随后利用PITA、miRanda和RNAhybrid软件预测57个差异表达miRNA的靶基因,并对靶基因进行GO和KEGG功能富集分析;GO分类主要富集于分子功能中的蛋白结合（Protein binding）;KEGG富集分析发现miRNA的靶基因主要富集于核糖体（Ribosome）以及NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）。挑选 4 个差异表达的 miRNA进行 qRT-PCR验证,发现其中miR-129a-3p差异倍数最大。进一步通过qRT-PCR检测PEDV侵染IPEC-J2细胞不同时间点（0h、24h、48h、72h）miR-129a-3p的表达变化,发现miR-129a-3p在PEDV侵染24h和48h时的表达均呈现极显著的下调（P＜0.01）。最终,本研究通过miRNA测序、表达验证结合文献挖掘确定miR-129a-3p作为仔猪肠道抵抗PEDV侵染的功能miRNA分子进行后续研究。2.miR-129a-3p靶向结合EDA基因的3’UTR区域降低mRNA稳定性参与调控PEDV侵染为进一步探究miR-129a-3p在PEDV侵染中的功能及其机制,首先利用qRT-PCR检测miR-129a-3p模拟物（mimics）和抑制物（inhibitor）的转染效率,结果显示,miR-129a-3p mimics能够极显著提高细胞内miR-129a-3p的表达水平（P＜0.01）,对应的miR-129a-3p inhibitor则显著抑制了 miR-129a-3p的表达水平（P＜0.01）。随后利用PEDV 侵染分别转染了 miR-129a-3p mimics 和 inhibitor 的 IPEC-J2 细胞,通过 PEDV M基因拷贝数的检测、TCID50以及Western blot实验,发现miR-129a-3p mimics抑制了 PEDV的复制增殖,miR-129a-3p inhibitor促进了 PEDV的复制增殖。以上结果表明,miR-129a-3p的高表达抑制了 PEDV在IPEC-J2细胞中的复制。为了进一步研究miR-129a-3p的靶基因及其下游调控机制,使用PITA、miRanda和RNAhybrid软件预测发现EDA是miR-129a-3p潜在的靶基因;随后,通过双荧光素酶实验验证发现miR-129a-3p与EDA基因3’UTR区域存在结合位点。为了进一步验证miR-129a-3p可以调控EDA基因表达水平,本研究通过Western blot实验检测转染了 miR-129a-3p mimics和inhibitor的IPEC-J2细胞中EDA蛋白的表达水平,结果发现miR-129a-3p mimics可以抑制EDA蛋白的表达,而miR-129a-3p inhibitor能促进EDA蛋白的表达。以上结果表明,miR-129a-3p负调控EDA的表达。为了研究靶基因EDA在PEDV侵染中的功能,本研究首先通过qRT-PCR检测PEDV侵染IPEC-J2细胞不同时间点（0h、24h、48h、72h）EDA的表达变化,结果显示,EDA基因在24h和48h时呈现极显著的表达上调（P＜0.01）。为了进一步研究靶基因EDA在PEDV侵染中所发挥的调控作用,本研究构建了EDA基因过表达的IPEC-J2细胞系,检测EDA基因过表达前后对PEDV复制能力的影响,通过PEDV M基因拷贝数的检测、TCID50以及Western blot实验,发现EDA过表达可以促进PEDV的复制增殖。以上结果表明,EDA高表达能够增强PEDV在IPEC-J2细胞中的复制能力。3.miR-129a-3p/EDA轴靶向激活NF-κB通路机制分析为了进一步探究EDA下游调控机制,使用RNA-seq获得EDA过表达细胞（EDA-OE）、猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）和PEDV侵染猪小肠上皮细胞（PEDV-J2）的转录组数据。转录组差异表达基因分析结果显示,EDA-OE与IPEC-J2两组间共有214个差异表达基因,其中EDA-OE组上调123个,下调91;PEDV-J2与IPEC-J2两组间共943个差异表达基因,其中PEDV-J2组上调598个,下调345个。将EDA-OE与IPEC-J2两组间和PEDV-J2与IPEC-J2两组间的差异基因取交集,结果发现共同的差异基因有83个,主要参与酮酸代谢过程（oxoacid metabolic process）和有机酸代谢过程（organic acid metabolic process）两大GO分类。对83个差异基因进行KEGG分析,其中top3显著的是磷脂酶D信号通路（Phospholipase D signaling pathway）、NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）以及花生四烯酸代谢通路（Arachidonic acid metabolism）。NF-κB信号通路与病毒侵染密切相关,为了验证miR-129a-3p表达变化与NF-κB信号通路之间的关系,本研究分析了在PEDV侵染过程中转染了 miR-129a-3p mimics的IPEC-J2细胞中NF-κB通路的活性,结果发现,在PEDV侵染IPEC-J2细胞过程中miR-129a-3p表达上调可以激活NF-κB信号通路;进一步通过qRT-PCR以及Western blot实验,发现miR-129a-3p mimics转染细胞后可以显著抑制PEDV的复制增殖,这种抑制作用可以被NF-κB通路抑制剂BAY 11-7028所阻断。为了验证miR-129a-3p通过影响NF-κB通路中CARD11基因的表达从而在PEDV侵染中发挥调控作用,本实验通过qRT-PCR以及Western blot检测CARD11的表达情况,结果表明,在PEDV侵染过程中miR-129a-3p mimics可以上调CARD11基因的表达水平,这种上调作用可以被BAY 11-7028所阻断。最后对NF-κB通路下游细胞因子IL-12、IL-1β、IFN-α、IFN-β和IFN-γ进行qRT-PCR检测,发现在PEDV侵染过程中miR-129a-3p mimics可以显著上调IL-12、IL-1β、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的表达水平（P＜0.05）。以上结果表明,miR-129a-3p高表达可以激活NF-κB通路进而促进下游细胞因子的释放。综上,本研究初步揭示了 miR-129a-3p/EDA轴可以通过靶向激活NF-κB通路调控PEDV的侵染和复制水平,为今后的抗病育种工作提供了一定的指导和依据,同时有望为miR-129a-3p作为潜在的分子标记物开展PED治疗药物的研发提供研究理论依据和实验基础。