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脱氢乙酸钠(Sodium dehydroacetate,DHA-S)具有广谱的抗菌作用,作为防腐剂被广泛应用于食品、化妆品、饲料等。资料报道及本课题组前期研究发现脱氢乙酸钠可导致大鼠凝血障碍,存在出血倾向。脱氢乙酸钠所致凝血异常与抑制肝脏中维生素K 环氧化物还原酶复合物亚基 1(Vitamin K 2,3-epoxide reductase complex submit 1,VKORC1)和 VKORC1 样蛋白 1(VKORC1-like protein 1,VKORC1L1)有关。本文在大鼠BRL3A肝细胞培养中,运用靶向大鼠Vkorc1/Vkorc1l1基因的siRNA,分别干扰VKORC1和VKORC1L1蛋白表达,研究脱氢乙酸钠对大鼠肝细胞凝血因子影响的VKORC1/VKORC1L1 机制。在有效干扰目的基因的siRNA筛选中,首先利用荧光标记的阴性siRNA,筛选出合适的siRNA转染条件。将靶向Vkorc1和Vkorc1l1基因的各三条siRNA序列转染大鼠BRL3A肝细胞中,通过RT-PCR和Western blot检测,筛选出可有效沉默Vkorc1基因的siRNA序列为si403,蛋白水平上沉默效率为50%以上;可有效沉默Vkorc1l1基因的siRNA序列为si1,蛋白水平上沉默效率达70%。在检测不同浓度DHA-S对大鼠肝细胞活性和增殖情况的影响中,选择2.0、5.0、10.0 mmol/L脱氢乙酸钠处理大鼠BRL3A肝细胞24h后,MTT法检测细胞活性,EdU法检测细胞增殖。结果表明除了 10.0 mmol/LDHA-S显著抑制肝细胞活性(P<0.05),极显著降低肝细胞增殖(P<0.001)外,其他剂量均无显著影响。以5.0 mmol/LDHA-S用于后续试验。在研究DHA-S对肝细胞凝血因子影响VKORC1/VKORC1LL1机制中,选择si403-siRNA 和 sil-siRNA 分别靶向干扰Vkorc1和Vkorc1l1基因。siRNA 转染 BRL3A肝细胞 24 h 后,加入 5.0 mmol/LDHA-S 共处理,RT-PCR 和 Western blot 检测 VKORC1和VKORC1L1的mRNA水平和蛋白表达水平。ELISA法检测细胞或培养上清中维生素K(Vitamin K,VK)和凝血因子IX(FIX)的水平。结果表明,①5.0 mmol/L DHA-S对BRL3A细胞活性、增殖和Vkorc1/Vkorc1l1 mRNA无显著影响,但能显著降低细胞中VK、FIX水平和VKORC1/VKORC1L1蛋白表达水平。② siRNA靶向干扰Vkorc1并与DHA-S共处理后,VKORC1的mRNA及蛋白水平显著降低(P<0.05),VKORC1L1稍上升但无显著性差异,细胞或上清中VK、FIX显著降低(P<0.05)。与DHA-S组比较,共处理组培养上清及细胞中VK含量分别下降了约6.5%和8.0%,但与PBS组比较,共处理组培养上清及细胞中VK含量分别显著下降了约35.2%和11.7%(P<0.01);与DHA-S组比较,共处理组培养上清及细胞中FIX含量也分别下降约14.5%和4.1%,但与PBS组比较,共处理组培养上清及细胞中FIX含量,分别显著下降了约31.3%和12.3%(P<0.01)。③siRNA靶向干扰Vkorc1l1并与DHA-S共处理后,VKORC1无显著变化,VKORC1L1的mRNA及蛋白水平显著降低(P<0.01),细胞和上清中VK、FIX也显著降低(P<0.01)。与DHA-S组比较,共处理组培养上清及细胞中VK水平分别降低约1.0%和3.8%;但与PBS组比较,共处理组培养上清及细胞中VK含量分别显著降低了约13.7%和12.4%(P<0.001)。与DHA-S组比较,共处理组培养上清及细胞中FIX水平分别降低约5.9%和4.2%(P<0.01);但与PBS组比较,共处理组培养上清及细胞中FIX分别显著降低了约11.7%和7.8%(P<0.001)。④siRNA靶向Vkorc1和Vkorc1l1共干扰并与DHA-S共处理后,与DHA-S组比较,共处理组培养上清及细胞中VK水平分别降低约21.0%和8.9%(P<0.01);但与PBS组比较,共处理组培养上清及细胞中VK含量分别显著降低了约33.1%和15.7%(P<0.001)。与DHA-S组比较,共处理组培养上清及细胞中FIX水平分别降低约25.7%和21.7%(P<0.01);但与PBS组比较,共处理组培养上清及细胞中FIX分别显著降低了约35.2%和28.2%(P<0.001)。综上所述DHA-S可抑制大鼠BRL3A肝细胞中VK和FIX水平、抑制VKORC1和VKORC1L1的表达;初步的研究认为DHA-S降低大鼠肝细胞中凝血相关因子水平的机制,是通过抑制肝细胞中VKORC1和VKORC1L1的表达,且VKORC1的调节占主要作用。