【摘 要】
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溶菌酶作为一种非特异性免疫因子具有杀菌、消炎、抗病毒等作用,所以可开发为药物和防腐剂,从而代替部分抗生素对人体免疫力的负面影响和防腐剂对人体的慢性伤害。以毕赤酵母
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溶菌酶作为一种非特异性免疫因子具有杀菌、消炎、抗病毒等作用,所以可开发为药物和防腐剂,从而代替部分抗生素对人体免疫力的负面影响和防腐剂对人体的慢性伤害。以毕赤酵母(Pichia pastor is) GS115为宿主菌表达海洋生物溶菌酶,即牡蛎溶菌酶(Crassostrea gigas Lysozyme, CgLys)和海参溶菌酶(Stichopus japonicus Lysozyme,SjLys)。首先,以海洋生物组织中提取的总RNA为模板,根据海洋生物溶菌酶在GeneBank中已发表的溶菌酶基因的成熟肽序列来设计合成特异性引物,并引入EcoR I和Not I两个酶切位点,通过RT-PCR扩增分别获得CgLys和SjLys基因,并将其克隆至真核表达载体pPIC9K上,经BgⅡ线性化后电转化至P.pastoris GS115。经MD和MM平板筛选出表型为His+Muts的阳性菌株,再经含G418不同浓度抗生素的YPD平板筛选高拷贝阳性菌株。最后,在摇瓶培养中添加终浓度为0.5%的甲醇诱导牡蛎溶菌酶和海参溶菌酶的分泌。经甲醇诱导后,筛选出2株具有抑菌活性的高拷贝重组牡蛎溶菌酶(rCgLys)基因工程菌,分别命名为GS115/pPIC9K-CgLys-31和GS115/pPIC9K-CgLys-42;3株具有抑菌活性的高拷贝重组海参溶菌酶(rSjLys)基因工程菌,分别命名为GS115/pPIC9K-SjLys-20、GS115/pPIC9K-SjLys-66以及GS115/pPIC9K-SjLys-67。其中,基因工程菌GS115/pPIC9K-CgLys-31和GS115/pPIC9K-SjLys-66的发酵上清液经SDS-PAGE检测,在14.3kDa处有一明显条带,与预期的溶菌酶蛋白分子质量相一致,而作为阴性对照中没有此条带。牡蛎溶菌酶和海参溶菌酶均在P. pastoris中获得了可溶性表达,其分泌的牡蛎和海参溶菌酶产物对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、铜绿假单胞菌均有抑菌作用。本研究为利用毕赤酵母表达系统规模化生产海洋生物溶菌酶奠定了理论基础和技术基础,这对带动海洋生物溶菌酶的工业化生产提供了有效地途径。
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