背景与目的肠黏膜屏障功能是指正常肠道具有较为完善的功能隔离带,可防止致病性病原体及毒素的侵入。在严重创伤、大面积烧伤、出血性休克、手术、放化疗、长期应用广谱抗生素或免疫抑制剂、营养不良、重症胰腺炎等应激状态下或长期进行肠外营养的情况下,肠道的结构和功能可能受到严重损害,导致肠道屏障功能障碍,进而引起肠道细菌易位,甚至诱发全身炎性反应综合征(SIRS),进而导致多器官功能衰竭(MODS)而危及生命。如何及时正确评估肠道屏障功能对于判断患者的病情、估计其预后、并及时给予综合治疗具有非常重要的意义。但目前直接观察肠道屏障功能仍较困难,多通过间接的方法进行监测。D-乳酸是胃肠道固有细菌的代谢终产物,肠道多种细菌均可产生。哺乳动物体内不具备将其快速代谢分解的酶系统。当肠黏膜生物屏障受损时,其通透性增加,肠道中细菌产生的D-乳酸通过受损肠黏膜经循环入血,由于哺乳动物没有D-乳酸脱氢酶,此时可见血中D-乳酸水平升高。因此检测其外周血水平即可反映肠黏膜损害程度和通透性的变化。二胺氧化酶(DAO)是人类和所有哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中具有高度活性的细胞内酶,当肠黏膜上皮细胞受损、坏死后该酶释放入血,或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔内,导致血浆和肠腔内DAO活性增高而肠黏膜DAO活性降低。由于DAO在外周血中活性稳定,因而可通过无创测定其在外周血中的变化,间接反映肠黏膜状态,但它主要反映的是肠黏膜上皮损伤与修复情况,而不是肠道通透性的改变。白细胞的过度激活是炎性病理过程中的一个重要环节。白细胞是否停滞并以浸润方式向血管外渗依赖于炎症部位白细胞和内皮细胞膜表面的黏附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)的表达与功能。ICAM是指由细胞合成并组装于细胞表面或分泌至细胞外基质的可促进细胞与细胞或细胞与细胞外基质间黏附的一类糖蛋白。其中ICAM-1属于免疫球蛋白超家族,在炎性肠病发病中的作用近年来受到关注。正常肠组织ICAM-1通常低水平表达于血管内皮细胞、肠黏膜固有层和淋巴结中的单核巨噬细胞。髓过氧化物酶(MPO)是主要存在于中性粒细胞中的一种酶,其活性高低反应了中性粒细胞浸润程度。超氧化物歧化酶(SOD)是内源性超氧阴离子自由基清除剂,其活性高低可部分反映机体清除自由基的能力。现在研究发现,肠道损伤所涉及的缺血、炎症、凋亡等多个病理机制与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)信号道路的调节有关,p38在炎性反应起重要作用。目前,对肠黏膜屏障功能的保护尚缺乏令人满意的有效手段,因此寻找自然界存在的对人类疾病有治疗作用的药物已成为医学界和药学界共同关注的课题。姜黄素是一种天然低毒的药用植物,被世界卫生组织/食品管理局批准为天然食品添加剂。国内外许多文献相继报道姜黄素具有抗感染、抗炎、抗氧化、清除自由基等作用。最近的研究表明:姜黄素能通过抑制NF-κB、p38的活性,减轻实验性大鼠结肠炎,证明姜黄素通过抑制NF-κB的活性而增加TNF-a诱导的Caco-2细胞的紧密连接;姜黄素通过抑制p38、JNK和NF-κB活性,减轻志贺样毒素与TNF-a诱导的HT29细胞株的结合,减少细胞的死亡。本课题拟通过建立大鼠小肠炎模型及LPS刺激IEC-6细胞的应激反应,观察姜黄素对肠黏膜屏障的保护作用以及对MAPK信号传导通路、MKP-1、核转录因子NF-κB、炎症介质和化学介质的影响,探讨姜黄素对肠黏膜作用的分子机制。材料与方法一、姜黄素对大鼠肠黏膜的保护作用及机制的研究采用腹腔内注射氨甲蝶呤(MTX)的方法制备SD大鼠小肠炎模型。将60只大鼠随机分为正常对照组(腹腔内注射生理盐水)、模型组(MTX,20mg/kg)、姜黄素组(curcumin 100mg/kg)和N-乙酰半胱氨酸组(NAC,150mg/kg),制模当天开始,每日按剂量灌胃一次,正常对照组和模型组灌生理盐水。制模过程中每天观察大鼠腹泻和肉眼血便情况,在实验第6d处死大鼠,取部分肠段置于多聚甲醛内固定、包埋、切片、HE染色,行一般组织病理学观察,30～50mg肠黏膜提取RNA、肠上皮细胞胞浆蛋白。1,观察大鼠疾病活动指数(DAI)和小肠黏膜损伤指数(CMDI),光镜下组织学评分(HS)。2,分光光度法检测血浆D-乳酸和DAO水平。3,生化法检测大鼠小肠组织MPO和SOD活性。4,运用ELISA测定大鼠血浆IL-10水平。5,应用RT-PCR技术对大鼠肠上皮细胞内致炎细胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表达水平进行检测。6,Western blot分析胞质内IκB的降解、p38、ERK、JNK蛋白表达。二、姜黄素对LPS诱导IEC-6细胞应激反应的保护作用及机制应用大鼠肠上皮细胞株IEC-6细胞,以脂多糖作为刺激因素,将对数生长期的细胞随机分为正常对照组、脂多糖(LPS)组、姜黄素(curcumin pretreat,20μmol/l)预孵组、p38抑制剂SB203580预孵组(SB pretreat,20μmol/l)。正常对照组不加任何处理因素,其它3组均加入LPS,浓度为100ng/ml。姜黄素预孵组和p38抑制剂SB203580预孵组在加入LPS前60min分别加入浓度为20μmmol/l的姜黄素和SB203580。孵育30min后终止。1,运用ELISA测定细胞上清液IL-10水平。2,应用RT-PCR技术对IEC-6细胞TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表达水平进行检测。3,应用NF-κB激活—核转运检测试剂盒检测NF-κB(p65)在细胞核内的分布。4,Western blot分析胞质内IκB的降解和MKP-1蛋白表达。结果一、姜黄素对大鼠肠黏膜的保护作用及机制的研究1、姜黄素对大鼠粪便性状和肠黏膜组织学的影响MTX组在腹腔内注射氨甲蝶呤后,第2d即出现腹泻,第3d部分出现肉眼血便,第6d全部出现肉眼血便。curcumin治疗组与NAC组症状无明显差别,于第3d开始出现腹泻、解黄色稀便等现象,但未出现血便,第6d也部分出现肉眼血便。组织切片观察发现:MTX组见黏膜及黏膜下层血管高度扩张充血,肠隐窝形态的丧失、绒毛萎缩、脱落,炎症细胞广泛浸润,呈典型炎症改变;curcumin治疗组与NAC组治疗组炎症明显减轻,肠隐窝形态丧失、绒毛萎缩、脱落现象较模型组明显减轻,炎症细胞浸润少。正常对照组无改变。以上结果说明:姜黄素对SD大鼠小肠炎有明显的治疗作用,对肠黏膜有保护作用,能够防止炎性细胞浸润,减弱炎症反应,减轻肠炎症状。2、姜黄素对肠黏膜MPO、SOD活性的影响模型组肠黏膜SOD、MPO活性分别明显高于正常组(P=0.000),姜黄素组和NAC组均可下调MPO活性,增强SOD活性。而且姜黄素可明显增强大鼠肠黏膜组织SOD表达,降低肠黏膜组织MPO活性。说明姜黄素具有抗氧化作用,同时可减轻炎细胞的浸润,对实验性大鼠小肠炎具有保护作用。3、姜黄素可改善肠黏膜通透性分光光度法检测血浆D-乳酸和DAO水平。结果显示:与正常组相比,MTX组D-乳酸和DAO水平明显升高(P=0.000)。curcumin组与NAC治疗组D-乳酸、DAO较MTX组有明显下降(P=0.000)。由此可见,姜黄素可以改善肠黏膜的通透性,对大鼠肠黏膜屏障具有保护作用。4、姜黄素对大鼠肠上皮细胞内细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10及ICAM-1表达的影响运用ELISA测定大鼠血浆IL-10水平,应用RT-PCR技术对大鼠肠上皮细胞内致炎细胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表达水平进行检测,结果显示:MTX组TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表达水平均较正常对照组明显增高,Curcumin组与NAC治疗组TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表达水平低于MTX组。但IL-10的表达高于MTX组(p=0.000),curcumin治疗组与NAC组治疗组之间差距无显著性(P=0.43)。上述结果表明:姜黄素对TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表达有明显抑制作用,对IL-10的表达有增强的作用。5、姜黄素对大鼠肠上皮细胞内IκB、MAPK信号转导通路的影响实验显示MTX组胞质中IκB明显降解。但姜黄素和NAC组的IκB的降解较MTX组明显减少。MTX组磷酸化p38明显增加,均较正常对照组明显增高(p=0.000),但磷酸化的JNK1/JNK2和ERK1/ERK2蛋白表达无明显改变。结果表明:在MTX诱导的大鼠小肠炎肠上皮细胞的炎症反应中,磷酸化p38增加,姜黄素对磷酸化p38有明显的抑制作用(p=0.000)。二、姜黄素对LPS诱导IEC-6细胞应激反应的保护作用及机制1、姜黄素对LPS诱导IEC-6细胞MKP-1、IκB、p65的作用LPS组磷酸化的MKP-1水平均较正常对照组明显增高(p=0.000),姜黄素和SB预孵组明显高于LPS组。LPS组胞质中IκB较正常对照组明显降解(p=0.000),但姜黄素和SB预孵组的IκB明显高于MTX组(p=0.000)。应用NF-κB激活—核转运检测试剂盒NF-κB(p65)在细胞核内的分布,通过免疫荧光染色检测发现:LPS组p65的核转运明显,核内红色荧光明显强于对照组,姜黄素和SB预孵组的红色荧光强于对照组,但弱于LPS组,说明LPS刺激的情况下,p65和IκB解聚,其核定位序列被暴露,从而被转运到细胞核内。但姜黄素能抑制p65的核转运。2、姜黄素对IEC-6细胞内致炎细胞因子TNF-α、IL-1β,抑炎因子IL-10和ICAM-1 mRNA表达的影响LPS组TNF-α、IL-1β、ICAM-1的表达水平均较正常对照组明显增高,IL-10明显减少。但姜黄素和SB预孵组的表达较LPS组表达明显减少,IL-10明显增高。上述结果表明:姜黄素对TNF-α、IL-1β、ICAM-1的mRNA表达有明显抑制作用,对IL-10表达有明显上调作用。结论一、姜黄素对MTX诱导的大鼠小肠炎肠黏膜的通透性有保护作用。姜黄素具有抗氧化作用,同时可减轻炎细胞的浸润。二、姜黄素能够减少MTX诱导的大鼠小肠炎与LPS诱导的IEC-6细胞应激反应模型的TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA的表达,增强IL-10 mRNA的表达。三、姜黄素对MTX致大鼠小肠炎模型的肠黏膜上皮NF-κB和p38信号转导通路有抑制作用,可以抑制NF-κB的激活和p38磷酸化。不影响对ERK、JNK蛋白的表达。四、姜黄素增强了LPS诱导的IEC-6细胞的MKP-1的磷酸化作用,进而抑制了p38活性。并且对NF-κB的活性有抑制作用。五、姜黄素对肠黏膜起保护作用的机制可能是通过增强MKP-1的磷酸化作用,抑制了NF-κB和p38活性,进而减少致炎细胞因子TNF-α、IL-1βmRNA和ICAM-1表达,增强抑炎因子IL-10的表达来实现的。