假体周围骨溶解是全关节置换术后最主要的远期并发症,在年轻患者中发生率高达34%,常导致假体的无菌性松动,需要二次返修手术。许多研究表明假体日常应用时产生的磨损颗粒在发病中可能起着关键的作用,其导致假体周围假膜的形成,促进假体周围的骨溶解。随着关节假体的材料、设计的改进,不同成分、大小和形状的磨损颗粒随之产生,它们会导致不同的机体免疫及炎症反应。磨损颗粒刺激全身造血细胞和假体周围细胞间传导联系,包括巨噬细胞、骨髓基质干细胞、成骨细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等,并分泌大量的细胞因子及化学因子,从而诱发破骨细胞的成熟和活跃,最终导致假体周围骨溶解和无菌性假体松动的发生。骨髓基质干细胞(BMSCs)作为成骨细胞的来源,大量存在于干骺端松质骨和假体周围的骨髓腔内,对维持骨的正常代谢,包括成骨及骨吸收,起到重要的作用。假体磨损颗粒会刺激骨髓基质干细胞,影响其分化成骨并诱导其参与假体周围炎症反应,使破骨增加,最终使假体松动的风险增大。在本次研究中,我们首先探讨不同材料的假体磨损颗粒(包括钛合金Ti,聚甲基丙烯酸甲酯PMMA,超高分子量聚乙烯UHMWPE,钻铬合金Co-Cr)对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化成熟、参与炎性反应等所产生的不同影响；然后再在体外研究钛颗粒刺激的骨髓基质干细胞(成骨细胞前体细胞)对外周血单核细胞分化为破骨细胞的影响；最后构建小鼠膝关节假体置换后无菌性松动的模型,通过该模型来进一步验证颗粒刺激的骨髓基质干细胞/成骨细胞前体细胞对破骨细胞分化成熟的重要调控作用。骨髓基质干细胞取自BALB/c小鼠双侧股骨髓腔,采用Histopaque(?)-1083密度梯度离心法分离后,置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃,5%CO2温箱培养。在分离出24小时后,加入10mM β-磷酸甘油,100nML-抗坏血酸,和10nM地塞米松诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶ALP染色、骨钙素OCN免疫组化染色来确定成骨细胞的有效分化。将诱导后的细胞分别与多种浓度的微米级的钛,聚甲基丙烯酸甲酯,超高分子量聚乙烯,钴铬合金颗粒共同培养(0.63,1.25,2.5和5mg/ml),并收集上清液。在颗粒刺激后多个时间点(1,3,5,7天)通过MTT来检测细胞的增殖反应。同时分别测定培养液及细胞内乳酸脱氢酶LDH的活性来反应不同颗粒的细胞毒性。再测定裂解的细胞液中ALP蛋白浓度,细胞的免疫化学染色(OCN,RANKL,ALP)来确定成骨细胞的分化程度。ELISA用来检测所收集上清液中的炎性细胞因子lL-1β,IL-6and TNF-α水平反映细胞对不同种类颗粒产生的不同炎性反应。RT-PCR测定细胞RANKL,OPG, LRP5,OSX, NFATc1和Runx2的基因表达。BALB/c小鼠外周血单核细胞通过离心法分离,将其置于钛颗粒刺激的培养骨髓基质于细胞的上清液中诱导,细胞TRAP染色检验单核细胞向破骨细胞分化程度。在体内实验部分,通过钛钉植入模仿膝关节置换术和关节内注射钛颗粒构建小鼠无菌性假体松动的模型,在术后将其分为两组,(1)成骨细胞组在关节腔内注射50μ1含5×105经钛颗粒刺激后的成骨细胞,并且在术后两周重复注射一次(n=12)；(2)假体松动对照组仅注射50μ1不含成骨细胞的培养液(n=12)；(3)无假体松动的稳定组作为阴性对照仅做钛钉植入手术,不注射钛颗粒和细胞。MicroCT用来测定假体周围骨密度的变化情况。术后四周取下小鼠的实验关节,通过拔钉力学试验反应假体是否稳定,拔钉后的组织做石蜡病理切片,首先测量植入物-骨界面膜的厚度反应假体周围炎症反应的程度,然后通过组织TRAP染色确定骨组织中破骨细胞分化成熟情况,最后自干骺端假体周围松质骨中提取RNA,反转录cDNA和RT-PCR来检测相关基因RunX2,Osterix/Sp7,MMP-2,IL-1,TNF-α,RANKL和TRAP的表达。取自小鼠双侧股骨髓腔的骨髓基质干细胞经过诱导后76.3±5.3%的细胞OCN染色阳性,85.3±3.9%的细胞ALP染色阳性,并在镜下逐渐表现为纺锤形或多形核的成骨细胞形态。MTT细胞增殖实验表明Ti,UHMWPE和Co-Cr颗粒在低浓度时都明显刺激骨髓基质干细胞的增殖,而高浓度的Co-Cr颗粒则明显抑制细胞的增殖反应(P<0.05),PMMA颗粒无论在低浓度还是高浓度时都对细胞的增殖无明显促进作用。相比较Ti和Co-Cr颗粒,低浓度的PMMA和EHMWPE颗粒对细胞分泌ALP无明显抑制作用；细胞免疫组化染色同样显示经过PMMA和UHMWPE刺激的细胞有较高的ALP/OCN阳性染色(P<0.05)。UHMWPE和Ti颗粒刺激细胞分泌更多的炎性细胞因子(IL-1β, IL-6和TNA-α)。RT-PCR显示不同的颗粒诱导骨髓基质干细胞/成骨细胞前体细胞表达出完全不同的基因水平,但相比低浓度水平(0.5mg/ml),所有种类的颗粒都在高浓度(3mg/ml)时刺激细胞表达较高的RANKL水平,提示磨损颗粒刺激的骨髓基质干细胞/成骨细胞前体细胞通过分泌更高水平的RANKL在破骨细胞成熟和分化中起重要作用。用培养钛颗粒刺激的骨髓基质干细胞(48h)的上清液来诱导外周血单核细胞后,和普通培养的对照组外周血单核细胞相比,TRAP阳性细胞数明显增加(P<0.05)。成功构建小鼠膝关节无菌性假体松动模型,microCT示假体稳定组内植物固定好无明显移位,注射Ti颗粒后会导致明显的假体周围骨溶解,假体周围骨密度BMD明显降低(P<0.05)。关节腔内注射Ti颗粒刺激的成骨细胞(前体细胞)后,相比假体松动对照组,假体周围骨密度进一步降低(P<0.05)；拔钉力学试验示Ti钉-骨界面剪切力降低,Ti钉的稳定性下降；组织切片测量假体周围炎性反应膜的厚度增大；TRAP染色显示更多的破骨细胞分化成熟。RT-PCR显示注射Ti颗粒刺激的成骨细胞后,假体周围骨组织RNA表达更高的MMP-2,IL-1, TNF-α, RANKL,和TRAP水平,提示Ti颗粒刺激的骨髓基质干细胞/成骨细胞前体细胞对假体周围炎症反应、破骨细胞分化成熟以及骨吸收均有重要的调控作用,而反映成骨的基因如RunX2和Osterix/Sp7水平无明显变化。总之,骨髓基质干细胞对不同材料的磨损颗粒在各个方面均表现出完全不同的生物学特性,包括细胞增殖,成骨及炎症反应等。在本次研究中,不同颗粒对骨髓基质干细胞的影响不能简单地用好坏来评价：PMMA颗粒相比于其他几种材料Ti, UHMWPE, Co-Cr,明显抑制骨髓基质干细胞的增殖,但对其向成骨细胞分化的影响最小；Co-Cr颗粒抑制骨髓基质干细胞的成骨作用,但在低浓度时促进细胞的增殖；UHMWPE和Ti颗粒在细胞增殖和成骨细胞分化方面均较Co-Cr颗粒表现更好,但会刺激细胞分泌更多的炎性因子参与骨溶解。但每种颗粒对骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化均起不同程度的抑制作用,且颗粒刺激的骨髓基质干细胞都会分泌多种炎性因子参与假体周围炎性反应和骨溶解。更重要的,颗粒刺激的骨髓基质干细胞均会分泌较高水平的RANKL,这是目前公认的破骨细胞分化成熟的重要因子。在其他方面,骨髓基质干细胞／成骨细胞前体细胞还通过分泌TNF-α直接促使局部巨噬细胞向破骨细胞分化；分泌MMP直接参与骨溶解。事实上,这些因素(RANKL, MCP-1, TNF-α, MMPs)可能会同时参与到磨损颗粒导致的假体周围骨溶解过程中去。所以本研究最重要的结论是颗粒刺激的骨髓基质干细胞／成骨细胞前体细胞在破骨细胞分化成熟以及假体周围炎症反应中起到非常重要的作用。