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宫颈癌是全球女性中第二最常见的恶性肿瘤,占所有癌症的9.8%。全球每年约有500000宫颈癌新发病例,其中一半的人死于宫颈癌,而80%的死亡发生在发展中国家。HPV感染一直以来被认为是宫颈癌形成的主要致病因素,其中起关键作用的是致癌基因E6、E7。然而,许多研究显示存在约10%的子宫颈腺癌和一定比例的子宫颈鳞癌HPV检测为阴性。p53作为一个肿瘤抑制因子,它是控制细胞增殖的最主要因子之一。HPV E6致癌蛋白通过E6 AP与p53结合形成复合物,导致p53的下调;在正常的细胞中,p16是一个增殖的负性调节因子,它通过一个负性反馈环一旦Rb基因产物失活就使CDK4下调。E7与p Rb蛋白相互作用可以使这个负反馈环失活,导致p16上调,从而促进细胞周期从G1到S期。如今端粒酶的作用也被认为是宫颈癌形成或发展的主要因素。有研究表明在人恶性肿瘤和被转导的细胞系中端粒酶可被激活,从而得出在人恶性肿瘤的形成中端粒酶的激活是一个关键事件。端粒酶包括hTERC和h TERT两个亚基,前者在端粒延长期间作为模板,后者起催化作用,并具有逆转录活性。hTERC基因的扩增能阻止细胞凋亡,最终导致肿瘤的发生。HPV E6可激活h TERT来维持端粒的长度,从而导致细胞的永生化,导致肿瘤的形成。然而,临床实际工作中却发现存在HPV DNA及E6/E7mRNA均为阴性的宫颈癌病例。本研究通过对HPV DNA、E6/E7 mRNA及p16、p53、hTERC进行检测,旨在探讨HPV检测阴性SCC的存在,并深入分析三个指标在HPV检测阴性SCC中的表达及意义。目的通过对HPV DNA、E6/E7mRNA的检测,从而得出人类乳头状瘤病毒(human papilloma viruse,HPV)检测阴性子宫颈鳞癌的存在;检测p16、p53、hTERC在HPV检测阴性子宫颈鳞癌中的表达情况,探讨其与HPV检测阴性子宫颈鳞癌发生、发展的相关性,为研究HPV检测阴性子宫颈鳞癌的发病机制及治疗提供新的方向。材料及方法1.研究对象:本研究收集的样本均来自河南省人民医院(河南省郑州市)病理科档案室,为2013年10月-2015年05月经福尔马林溶液固定、石蜡包埋的宫颈组织标本。所选的病例其年龄大致在18-65岁之间,其中位年龄约为42岁。这些病例所对应的病人之前未曾检查过或者未发现患有宫颈疾病。收集宫颈组织蜡块875例。本研究已通过河南省人民医院伦理委员会的同意并取得了病人或病人家属的同意及签字。2.研究方法:应用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法对875例石蜡包埋的宫颈组织进行处理,染色结果由三名病理科年资较高的诊断医生进行评估,最后综合三名医生的评估结果做出最后诊断,诊断结果分为四组:225例正常或炎症病变(normal or inflammatory,NNL);低级别宫颈鳞状上皮病变(The Low Level of Cervical Squamous Intraepithelial Lesion,LSIL)总共有210例,高级别宫颈鳞状上皮病变(The High Level of Cervical Squamous Intraepithelial Lesion,HSIL)总共有200例,宫颈鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma of The Cervix,SCC)总共有240例。排除225例NNL病例。分别应用PCR-反向杂交法、b DNA技术对210例LSIL、200例HSIL及240例SCC宫颈组织样本进行HPV型别及E6/E7 mRNA的检测,随后对15例HPV(-)(15例DNA-/mRNA-)及25例HPV(+)(包括5例DNA-/mRNA+、20例DNA+/mRNA+)SCC样本进行p53、p16免疫组化染色及hTERC基因的FISH检测。3.统计学方法:本研究采用SPSS17.0统计软件(美国SPSS公司)进行数据分析。采用χ2检验、Kruskal-Wallis秩和检验等方法进行数据处理,其中P<0.05具有统计学意义。结果1.HPV DNA检测结果:本研究对650例宫颈组织样本进行HPV DNA检测及分析。HPV总检出率是94.62%(615/650);LSIL、HSIL、SCC中,HPV检出率分别是95.24%(200/210)、100%(200/200)、89.58%(215/240),其中后者较前两者低,三者之间差异具有统计学意义(P=0.00);LSIL组与HSIL组、LSIL组与SCC组、HSIL组与SCC组分别进行比较,结果显示差异均有统计学意义(P<0.05)。2.宫颈组织中E6/E7 mRNA的表达情况:E6、E7是HPV致癌的关键基因,当HPV DNA整合入宿主细胞基因时可导致E6、E7过表达,因此E6/E7 mRNA的检测可表明HPV的感染状态。本研究数据显示:各病变级别之间,E6/E7 mRNA百分比存在明显差异,具有正相关性(r=0.39,P=0.00)。对LSIL组与HSIL组、LSIL组与SCC组、HSIL组与SCC组中的mRNA百分比分别进行比较,结果显示第一组的差异无统计学意义(P=0.054),LSIL与SCC、HSIL与SCC之间的mRNA百分比均存在明显差异(P<0.001)。3.HPV DNA与E6/E7 mRNA的相关分析:本研究对SCC病例中HPV DNA及E6/E7 mRNA进行分析,结果显示存在87.5%DNA+/mRNA+病例、6.25%DNA-/mRNA-病例、2.08%DNA+/mRNA-病例、4.17%DNA-/mRNA+病例。而对于HSIL来说,DNA+/mRNA+病例百分比在SCC中相对较高,而DNA-/mRNA-病例百分比在SCC中相对较低,差异均具有统计学意义(P<0.001)。4.HPV DNA与E6/E7 mRNA的差异分析:本研究对各宫颈病变级别中的HPV DNA阳性率及E6/E7 mRNA阳性率进行对比分析。对于本实验中650例宫颈组织样本来说,HPV DNA、E6/E7 mRNA的检出率分别是94.62%、71.54%,两者之间进行比较分析,结果是具有统计学差异的(P<0.001)。LSIL中,HPV DNA检出率大于E6/E7 mRNA检出率,结果具有统计学差异(P<0.001);与LSIL中的差异相类似,HSIL中的HPV DNA检出率也大于E6/E7 mRNA检出率,结果具有统计学差异(P<0.001);在SCC中,HPV DNA阳性率小于E6/E7 mRNA阳性率,且差异具有统计学意义(P=0.008)5.p53、p16及hTERC基因的检测结果:本研究对HPV(-)组和HPV(+)组的SCC宫颈组织样本均进行了p53、p16免疫组化染色和hTERC基因的FISH检测,结果显示:p53在HPV(-)组和HPV(+)组的阳性百分比分别为66.67%、40%,两组之间p53阳性百分比无明显差异(χ2=2.667,P=0.102);两组中,p16阳性百分比分别为66.67%、100%,差异具有统计学意义(校正χ2=6.72,P=0.01)。hTERC基因检测结果显示:hTERC基因阳性表达率分别为66.67%HPV(-)组、80%HPV(+)组,差异无统计学意义(校正χ2=0.32,P=0.572)。结论1.存在HPV DNA及E6/E7 mRNA均为阴性的子宫颈鳞状细胞癌,即HPV检测阴性子宫颈鳞状细胞癌。2.与HPV检测阳性SCC相比,HPV检测阴性SCC的形成中p53、hTERC表达无明显差别,而p16表达较弱,其临床意义和机制需要进一步的研究。