论文部分内容阅读
茯砖茶具有独特的品质和明显的调理人体消化及降脂减肥功能。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯砖茶中的优势菌,与茯砖茶独特品质和保健作用的形成有密切联系。为了揭示二者的关系,本研究采用液体发酵技术、现代分离纯化技术、高通量筛选技术和LC-MS定性分析技术对冠突散囊菌进行了系统的研究,获得了如下研究成果:1.冠突散囊菌的分离纯化与液态发酵技术本研究直接从茯砖茶中挑取黄色闭囊壳,采用PDA培养基和平板划线法,获得了冠突散囊菌菌落。经显微镜检测和电镜扫描,发现该菌株的菌落、菌丝、子囊果、子囊孢子的结构和特征以及分泌物特性均具有典型冠突散囊菌的特性,经过18S rDNA鉴定,确认所分离的菌株为冠突散囊菌;该菌菌丝在液体发酵条件下紧密交织在一起呈菌丝球,并不断增大,发酵后期出现部分衰老自溶。采用单因素和正交试验对影响冠突散囊菌液体发酵的主要物质条件和环境因素进行了研究,发现冠突散囊菌生长时能很好的利用蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉和乳糖,适宜生长的pH为4-6,黑茶汁能促进其生长,其液体发酵的最佳培养基组成为:0.8%黑茶浸提液加6%的蔗糖。影响冠突散囊菌液体发酵的环境因子依次为:初始pH值>培养温度>接种量>摇瓶转数。冠突散囊菌液体发酵的最优培养条件为:初始pH值5.5、培养温度30℃、接种量1%（孢子浓度为5.0～6.0×108cfu/mL）、摇瓶转数120r/min。2.冠突散囊菌发酵过程中生化成分的动态变化经观察,发现冠突散囊菌液体发酵过程中发酵液色泽随发酵的进行逐渐加深,由最初的橙黄色变成棕褐色,且由澄清变成混浊,但发酵液粘度变化较小,并且随发酵的进行发酵液散发出越来越浓郁的特有的菌花香气。对冠突散囊菌液体发酵过程中有关生化成分的动态变化进行的研究发现:（1）冠突散囊菌液体发酵过程中菌丝的生长曲线呈S型,拟合的Logistic生长曲线方程为:y=0.371/(1+11.341e-0.051t（R2=0.93607）,其生长过程包括迟滞期（0-21h）、对数期（21-72h）、稳定期（72-96h）和衰亡期（>96h）。菌丝生长量在发酵84h前不断增加,第84h达到最大值0.3754g/100mL,发酵84h后部分菌体衰老减缓生长或停止生长,生长量呈下降的趋势。（2）冠突散囊菌液体发酵过程中,发酵液pH值呈下降趋势。其中:0-48h,发酵液pH值从5.51下降到4.05,发酵至48h,发酵液的pH值达到最低值（pH4.05）,然后开始回升,96h-120h发酵阶段,发酵液的pH值稳定在5.00左右。（3）冠突散囊菌液体培养过程中,发酵液中氨基酸含量呈先下降后回升的变化,但总体呈下降趋势。发酵0-84h,氨基酸总量下降了78.7%;发酵84h后,发酵液中氨基酸含量有所回升,发酵120h时,氨基酸含量上升到2.76mg/100mL。但发酵120h后,氨基酸含量下降了66.95%。说明,冠突散囊菌把氨基酸作为其生长繁殖的氮源物质是导致茯砖茶加工中氨基酸含量下降的主要原因。（4）冠突散囊菌液体培养过程中,发酵液中蔗糖含量逐渐减少,从发酵初期的5.95%降低到发酵终止时的2.57%。（5）冠突散囊菌液体培养过程中,发酵液中茶多酚、儿茶素总量明显下降,发酵120h后,发酵液中茶多酚总量减少了60.45%,儿茶素总量降低了73.68%。发酵液中各组分儿茶素和茶黄素在不同发酵时期其含量有波动,但总趋势是儿茶素和茶黄素减少,茶褐素大量增加（发酵120h后茶褐素增加了39.44%）,（TF+TR）/TB呈先升后降变化。说明,冠突散囊菌分泌多酚氧化酶是引起儿茶素各组分大幅度减少的主要原因。3.冠突散囊菌胞外多糖的提取、纯化及其化学和生物活性研究通过正交试验确定了冠突散囊菌液体发酵液胞外多糖提取的最佳工艺参数:浓缩比例为原液体的1/4,选用95%乙醇为沉淀剂,醇沉时间为10h。在该条件下,冠突散囊菌胞外多糖ECP（基础培养基）和ECP#（黑茶汁培养基）的提取量分别为195.2μg/mL和136.8μg/mL,其粗多糖中总糖含量分别为62.2%和70.1%。采用DEAE-52纤维素柱色谱和Sephadex G-100凝胶柱色谱对ECP和ECP#进行分离纯化。ECP经DEAE-52分离得到4个组分,其中1.0 mol/L NaCl洗脱部分（ECP-A）为主要组分,占68.69%;ECP#经DEAE-52分离得到4个组分,其中1.0mol/L NaCl洗脱部分（ECP#-A）为主要组分,占46.83%;ECP-A和ECP#-A再经Sephadex G-100分离分别得到多糖ECP-A1、ECP-A2和ECP#-A1、ECP#-A2,各多糖样品经UV扫描均不见蛋白质和核酸的吸收峰;经凝胶柱层析法测定其平均分子量分别为8.61×104Da,1.75×104Da,1.18×105Da和2.6×104Da;多糖TFA水解产物经气相色谱分析表明ECP-Al,ECP-A2,ECP#-A1和ECP#-A2的鼠李糖:阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖分别为12.73:2.47:23.75:1:1.79;0.97:3.13:2.76:1:0.81;0.18:0.93:0.05:1:0.23;1.43:6.31:0.73:1:0.85。IR、高碘酸氧化和Smith降解研究表明ECP-A1、ECP-A2、ECP#-A1和ECP#-A2的结构基本相似,均是不含糖醛酸的中性杂多糖,单糖残基以吡喃型存在,主链以α（1→3）、α（1→6）、α（1→2）或α（1→4）糖苷键连接。采用高通量筛选技术,以PPAR的三种亚型为受体,对冠突散囊菌胞外多糖的降脂减肥活性进行了筛选,结果表明,冠突散囊菌胞外多糖对PPARα、PPARγ、PPARδ三种模型均有活性,而且对PPARγ模型有强的活性,ECP和ECP#对PPARγ,模型激活值分别达1.63和1.41。以HepG2、K562细胞为试验对象对冠突散囊菌胞外多糖抑制肿瘤细胞的作用进行了筛选,结果表明,ECP对K562细胞有一定的抑制作用,但对HepG2细胞无抑制作用;ECP#试验所选的2个模型细胞均无抑制作用。4.冠突散囊菌发酵液的应用酶学研究采用体外模拟胃液和肠液环境研究了冠突散囊菌发酵液对α-淀粉酶、蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性的影响,并与绿茶、黑毛茶、茯砖茶和茶多酚复合物的作用进行比较。结果表明,所有试验样品对α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活性均有激活作用,冠突敞囊菌发酵液和茯砖茶汁的激活作用明显高于黑毛茶汁、绿茶汁和茶多酚复合物,冠突散囊菌发酵液的激活作用最强,其对α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的激活能力分别是对照的1.6倍、3.98倍和3.61倍。茶多酚复合物对α-淀粉酶的激活效果表现出量效关系。所有试验样品对脂肪酶活性均有不同程度的抑制作用。5.茯砖茶中的绿原酸衍生物的定性分析采用LC-MS定性分析技术研究了茯砖茶中绿原酸及其衍生物的存在和变化情况,首次发现在成品茯砖茶中存在两种绿原酸衍生物,即1,4-diCQA和4,5-diCQA;在茯砖茶坯中存在绿原酸衍生物肉桂酰奎宁酸（4-pCoQA）。