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汉坦病毒（hantanvirus）是肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renalsyndrome, HFRS）和汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome,HPS）的病原体。致病性汉坦病毒感染人体后以毛细血管和小血管的内皮细胞为主要靶细胞，在感染后数周内引发以血管渗漏综合征（vascular leakagesyndrome, CLS）和肾功能障碍为主要临床表现的临床综合征。目前血管内皮细胞损伤的机制研究主要包括病毒与其受体β3整合素结合后直接影响内皮细胞功能致病学说和以血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor, VEGF）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）等炎症介质升高和相关免疫细胞功能变化等免疫学致病学说。而具体机制有待深入研究。细胞骨架重构是调节血管内皮通透性升高的重要机制，而β3整合素和VEGF、TNF-α等均参与细胞骨架的调节。所以本研究以汉滩病毒（hantaanvirus, HTNV，致病性汉坦病毒中的主要型别）和体外培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVECs）为研究对象，以细胞骨架为切入点，研究细胞骨架重构是否参与了汉坦病毒感染以及VEGF、TNF-α对体外培养的血管内皮细胞通透性的影响；观察调节细胞骨架重构的重要分子RhoA/Rock/p-MLC的变化，以及Rock激酶抑制剂Y27632能否阻断或部分阻断血管内皮通透性的变化。旨在探讨汉坦病毒感染所致的血管内皮高通透性的发病机理，并为下一步深入研究减轻细胞高通透性的药物研究提供实验依据。主要研究方法和内容1. HTNV感染对HUVECs通透性影响实验（一）首先扩增并滴定HTNV76-118毒株并感染体外培养的HUVECs。运用跨内皮电阻测定（trans epithelial electrical resistance,TEER）、免疫荧光染色、流式细胞术等技术观察HTNV感染HUVECs不同时间点对内皮细胞通透性的影响，为后续实验提供相关数据及操作经验。2.细胞骨架重构在VEGF促进HTNV感染致HUVECs高通透性中的作用及机制实验（二）中以体外培养的HUVECs为对象，应用粘附实验、Transwell技术及流式细胞技术，观察VEGF对HTNV感染HUVECs的通透性、粘附能力和迁移能力的改变，分析β3与VEGFR2表达数量的变化；用荧光染色技术标记显示细胞骨架的重构；电子显微镜观察细胞间连接结构的变化；免疫蛋白印迹（western-blot）、逆转录实时定量PCR（q RT-PCR）方法检测β3-VEGFR2功能复合物下游参与细胞骨架重构的重要分子RhoA/Rock激酶、磷酸化的肌球蛋白轻链（myosin light chain phosphorylation, P-MLC）蛋白和mRNA水平上的变化。以上实验拟证实致病性汉坦病毒感染不仅影响β3整合素的功能，而且影响β3-VEGFR2复合物的功能，这可能是HFRS病程中VEGF水平升高而加剧血管内皮通透性的原因之一；RhoA/Rock/p-MLC分子通路参与的细胞骨架重构可能是VEGF促进HTNV感染HUVECs通透性升高的机制之一；Rock激酶的抑制剂Y27632可以部分阻断或减弱VEGF促进HTNV感染HUVECs高通透性的作用。3.细胞骨架重构在TNF-α致HTNV感染致HUVECs高通透性中的作用既往研究显示TNF-α的增高也参与了HFRS病程血管通透性的调节。而细胞骨架重构可能是TNF-α增加内皮细胞的通透性的重要通路。实验（三）采用内皮细胞电阻仪、免疫荧光染色、western-blot、qRT-PCR、电子显微镜等与第二部分实验中类似的实验方法观察TNF-α对HTNV感染的HUVECs通透性的作用，伴随通透性改变的细胞骨架重构情况、相邻细胞间连接结构的变化，RhoA/Rock/p-MLC等分子表达的变化；以及Y27632对上述作用有否影响。主要结果：1.单纯HTNV感染可以导致体外培养的HUVECs通透性升高。2. VEGF可以明显促进HTNV感染HUVECs通透性的升高，并伴随有β3整合素-VEGFR2复合体功能失调及细胞骨架的重构。3. RhoA/Rock/P-MLC分子通路可能参与VEGF介导的细胞骨架重构所致的通透性升高；Rock激酶抑制剂Y27632可以明显减轻上述作用。4. TNF-α可明显促进HTNV感染HUVECs通透性的升高，并伴随有细胞骨架的重构。5. RhoA/Rock/P-MLC分子通路可能参与TNF-α介导的细胞骨架重构所致的通透性升高；Rock激酶抑制剂Y27632可以明显减轻上述作用。结论1.细胞骨架重构可能是VEGF和TNF-α促进HTNV感染致HUVECs的高通透性的重要机制之一。2. RhoA/Rock/p-MLC分子通路可能是调节上述细胞骨架重构的重要信号途径，Rock激酶抑制剂Y27632具有明显减轻VEGF及TNF-α促进HTNV感染HUVECs高通透性的作用。