论文部分内容阅读
目的:观察冰片对睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)滴眼剂在视网膜分布以及对碘酸钠诱导的干性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)大鼠模型干预作用的影响,探讨冰片是否能通过提高CNTF滴眼剂在靶器官视网膜的生物利用度而增强其保护视网膜神经细胞的疗效,阐释冰片的引经作用及机制,为引经理论及引经药在眼科临床的应用提供客观依据,亦为研发防治视网膜变性疾病的滴眼剂开创新思路和新方法。方法:1.冰片对外源性CNTF在家兔视网膜靶向分布及代谢的影响:选用雄性新西兰家兔96只,1.5-2kg,随机分为六组:正常组、0.1%冰片基质滴眼剂组、2μg/mlCNTF滴眼剂组、0.1%冰片CNTF滴眼剂组、0.05%冰片CNTF滴眼剂组、0.025%冰片CNTF滴眼剂组。每组家兔16只。除正常组(不做任何处理)外,其余分别予0.1%冰片基质滴眼剂、2μg/mlCNTF滴眼剂、0.1%冰片+2μg/mlCNTF滴眼剂、0.05%冰片+2μg/mlCNTF滴眼剂、0.025%冰片+2μg/mlCNTF滴眼剂。双眼点药,5min一次,连点四次,分别在最后一次点眼后15min、30min、1h、2h处死家兔取出视网膜,用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法观察不同组别视网膜中CNTF蛋白含量。2.冰片对CNTF滴眼剂在干性AMD大鼠视网膜内分布及表达的影响:以碘酸钠尾静脉注射建立干性AMD模型,将造模后SD大鼠随机分为模型组、冰片滴眼剂组、CNTF滴眼剂组、冰片CNTF滴眼剂组,每组8只,于造模后右眼分别给予凝胶基质、冰片滴眼剂、CNTF滴眼剂、冰片CNTF滴眼剂点眼,4次/天,正常组常规饲养不做处理。给药7天以及14天后采用免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测SD大鼠视网膜外源性CNTF蛋白含量及位置,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测内源性CNTF表达情况。3.冰片对CNTF滴眼剂保护视网膜变性作用的影响:造模、分组及给药方法同2,给药7天及14天后采用视网膜电图(electroretinogram,ERG)检测视网膜功能,病理学切片、HE染色方法观察视网膜组织病理学情况,免疫荧光法检测视网膜胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达,从组织形态学、视网膜功能等方面探讨冰片对CNTF干预大鼠视网膜变性作用的影响。结果:1.冰片对CNTF在家兔视网膜靶向分布及代谢的影响:给药15min时,0.025%冰片CNTF组最高(42.72±0.97pg/ml),后依次是0.1%冰片 CNTF 组(39.88±0.71pg/ml),0.05%冰片 CNTF 组(35.84±0.55pg/ml),CNTF组(35.30±1.17pg/ml),各组间差异有统计学意义(P<0.05)。给药30min时,各组视网膜内CNTF含量明显下降,组间相比趋势与15min时相同,为0.025%冰片 CNTF(18.05±0.75pg/ml)>0.1%冰片 CNTF 组(16.55±1.23pg/ml)>0.05%冰片 CNTF 组(9.97±1.42pg/ml)>CNTF 组(9.30±1.40pg/ml)(P<0.05);给药lh后,各组视网膜内CNTF含量继续下降,0.025%冰片CNTF组仍最高(14.72±1.09pg/ml)与其他组相比差异具有统计学意义(P<0.05);给药两个小时,除0.05%冰片CNTF组含量略有增加,其它三组含量较给药1小时下降,各组浓度由高至低顺序依次为0.025%冰片CNTF组>0.1%冰片CNTF组>0.05%冰片CNTF组>CNTF组,0.025%冰片CNTF含量最高,差异有统计学意义(P<0.05),其他三组之间差异不具有统计学意义(P>0.05)。2.冰片对CNTF在干性AMD大鼠视网膜内分布及表达的影响:免疫荧光检测显示:给药7天时,模型组未见明显红色荧光,CNTF组除神经节细胞层(Ganglion cell layer,GCL)、内核层(inner nuclear layer,INL)、脉络膜层可见散在点状红色荧光外,在视网膜色素上皮层(Retinalpigment epithelium,RPE)内侧可见短条状红色荧光,冰片CNTF组除上述各层可见红色荧光外,在玻璃体靠近视网膜内界膜位置及视网膜色素上皮下腔隙可见条状荧光。给药14天时,CNTF组视网膜色素上皮层可见团状荧光,视网膜色素上皮层下腔隙可见短条样红色荧光,冰片CNTF组红色荧光染色较其它各组明显增多,分布在视网膜色素上皮层、外核层(Outer nuclear layer,ONL)、视网膜色素上皮层下腔隙、外丛状层(Outerplexiform layer,OPL)、内核层。RT-qPCR检测结果显示:给药7天时,各组内源性CNTFmRNA相对表达量分别为正常组:1,模型组:1.65±0.46,冰片组:1.94±1.12,CNTF 组:1.62±0.42,冰片CNTF组:1.72±0.92。模型组、冰片组、CNTF组及冰片CNTF组之间数据差异不具有统计学意义(P>0.05)。给药14天时,各组内源性CNTFmRNA相对表达量分别为:正常组:1,模型组:1.84±0.92,冰片组:1.40±0.69,CNTF组:1.33±1.07,冰片CNTF组:1.23±0.88。模型组、冰片组、CNTF组及冰片CNTF组之间数据差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.冰片对CNTF滴眼剂保护视网膜变性作用的影响:ERG检查结果显示:给药14天时,暗适应3.0ERGa波振幅,正常组、模型组、冰片组、CNTF组及冰片CNTF组各组数据分别为:148.06±34.70、10.61±4.52、10.61±4.52、13.37±7.00、24.30±8.46、46.48+5.65,各组数据差异具有统计学意义(P<0.05);模型组数值明显低于正常组(P<0.05),冰片CNTF组数值明显高于模型组、冰片组、CNTF组(P<0.05)。暗适应震荡电位(OPS)正常组、模型组、冰片组、CNTF组及冰片CNTF组数值分别为:134.66±42.75、10±1.62、11.26±1.5、25.61±3.04、57.41±18.64,各组数据差异具有统计学意义(P<0.05);模型组数值明显低于正常组(P<0.05),冰片CNTF组数值明显高于模型组、冰片组、CNTF组(P<0.05)。明适应闪烁光电位振幅正常组、模型组、冰片组、CNTF 组及冰片 CNTF 组分别为:54.66±9.80、10.50±1.97、10.40±4.46、10.70±2.16、20.14±5.05,各组数据差异具有统计学意义(P<0.05);模型组数值明显低于正常组(P<0.05),冰片CNTF组数值明显高于模型组、冰片组、CNTF组(P<0.05)。冰片CNTF组自身左右眼对比暗适应ERG、最大反应ERG、暗适应振荡电位、明适应 ERG、闪烁光 ERG,左眼数据分别为:39.01±30.3、21.48土7.01、28.67±6.50、17.40±5.98、16.91±2.89,右眼数据分别为:58.59±40.96、46.48+5.65、57.41±18.64、16.95±6.33、20.14±5.05,其中暗适应最大反应ERG振幅、暗适应震荡电位振幅和及明适应闪烁光电位振幅右眼明显高于左眼(P<0.05)。病理组织学观察结果显示:给药7天时,模型对照组视网膜色素上皮层及外核层出现明显损伤,细胞数目减少,排列紊乱,呈现波浪样改变,ONL细胞数正常组、模型组、冰片组、CNTF组、冰片CNTF组数据分别为:199.37±15.95、107.63±13.90、109.88±11.27、108.5±10.77、125.12±9.14,模型组数值明显低于正常组(P<0.05),冰片CNTF组明显高于模型组、冰片组及CNTF组(P<0.05);给药14天时模型组改变与7天相似,ONL细胞数正常组、模型组、冰片组、CNTF组、冰片 CNTF 组数据分别为 134.66±42.75、10±1.62、11.66±1.5、25.61±3.04、57.41±18.64,模型组数值明显低于正常组(P<0.05),冰片CNTF组明显高于模型组、冰片组及CNTF组(P<0.05)。GFAP免疫荧光结果显示:正常大鼠视网膜内界膜(inner limiting membrane,ILM)可见少许斑状GFAP红色荧光着色,其余视网膜各层均未见阳性染色。7天时,模型组视网膜ILM可见GFAP红色荧光明显增强增宽,条状红色荧光从ILM层贯穿至内核层。冰片组与模型组相近,内核层及内丛状层荧光较模型组弱,CNTF组及冰片CNTF组内核层及内丛状层未见明显红色荧光着色,冰片CNTF组内界膜处的荧光较CNTF组略弱。14天时,各组表现趋势与7天类似,各组红色荧光表达进一步增强,模型组内界膜、神经纤维层(nerve fiber layer,NFL)、神经节细胞层均可见非常强的红色荧光,此外模型组及冰片组的条状荧光增强、增多、增粗,贯穿整个视网膜,CNTF组及冰片CNTF组也可见条状荧光,但多局限在内界膜至内丛状层内侧,冰片CNTF组外界膜至神经节细胞层的荧光较CNTF组少。结论:1.冰片可以促进外源性CNTF在正常家兔视网膜的分布,冰片的浓度对促进作用有一定影响。2.冰片可以促进外源性CNTF在实验性干性AMD大鼠视网膜内分布,提示冰片可以增加CNTF以滴眼剂方式给药的靶向生物利用度。3.冰片CNTF眼用凝胶可以明显减轻实验性干性AMD大鼠模型视网膜病变程度,改善视网膜功能,其保护作用较单纯CNTF滴眼剂显著增强,冰片在滴眼剂中发挥了重要的“引经”作用。