论文部分内容阅读
目的：本研究通过对健康献血员和严重烧伤患者进行LBP Phe436Leu、CD14C-159T、TLR4 Asp299Gly、TLR4 Thr3 99Ile基因多态性检测，分别探讨其基因多态性对离体全血以及烧伤患者体内细胞因子基因表达和蛋白水平的影响与调节机制，并进一步分析与烧伤患者脓毒症易感性和预后的关系。旨在为临床表型的个体间差异提供理论依据，并为预防和治疗烧伤后脓毒症及MODS提供新的思路。 方法：（1）体外实验全血标本来自118例健康献血员（18～51岁），标本收集在无致热源EDTA-K2试管中。按1：1比例与RPMI1640培养液混合。按是否用100ng/ml LPS刺激分为对照组与实验组。于37℃，5％CO2中孵育12h。上清液与血细胞分别冻存于-70℃备用。（2）临床研究对象为烧伤总面积大于30％的患者26例，年龄19～57岁。按烧伤严重程度分为重度烧伤组与特重烧伤组。分别于伤后第1、3、7、14、28天采集EDTA-K2抗凝全血标本。血浆及血细胞分别冻存于-70℃备用。LBP Phe436Leu、CD14 C-159T、TLR4 Asp299Gly及TLR4 Thr399Ile基因多态性的检测采用限制性內切酶消化PCR产物军医进修学院硕1:论文方法判定。LBP、CD14及TNF一a mRNA表达采用半定量RT一PCR方法检测，以p一aetin作为内参对照。LBP、SCol4、TNF一a、xL一6及IL一10浓度采用酶联免疫吸附方法检测。并对不同基因型与脓毒症、MODS发病率及患者预后的关系进行分析。结果:（l）通过对118例健康献血员LBP、CD14及TLR4分子基因型进行检测，结果显示等位基因LBP436Phe及LBP436Leu频率分别为94.1%和5.9%。14例为杂合子 （Phe/Leu，11，9%），其余均为Phe纯合子（Phe/Phe，88.10，0）。等位基因CD14一159T和CD14一159C的频率分别为60.2%和39.8%。40例为TT纯合子（33.9%），62例为杂合子（TC，52.5%），16例为CC纯合子（13.6%）。未检测到TLR4 Asp299Gly及TLR4 Thr399lle基因多态性。（2）LBP 436 Phe/Leu基因型全血细胞培养上清液LBP蛋白浓度高于Phe/Phe基因型，但LBPPhe436Leu基因多态性与LPS刺激后TNF一a、IL一6及IL一10生成及CD14表达无关。（3）LPS刺激前后，CC纯合子的CD14mRNA表达及sCD14浓度在三种基因型间最低，但基因型TT与TC之间差别不明显。（4）CD14一159TT纯合子的TNF一a浓度明显高于TC杂合子及CC纯合子，而IL一10产生则恰好相反，明显低于后两者。（5）通过对26例严重烧伤患者LBP、cD14及TLR4分子的基因型进行检测发现，等位基因LBP 436Phe及LBP436Leu的频率分别为98.1%和1.9%。只有1例为杂合子（phe/Leu，3 .8%），其余均为phe纯合子（Phe/Phe，96.2%）。军医进修学院硕士论文等位基因CD14一159T和CD14一159C的频率分别为57.7%和42.3%。8例为TT纯合子（30.8%），14例为杂合子（TC，53.8%），4例为CC纯合子（15.4%）。未检测到TLR4Asp299Gly及TLR4Thr399lle基因多态性。（6）烧伤后第3、7天，杂合子的CD14mRNA表达较CC纯合子高，烧伤后第14、28天，TT纯合子与TC杂合子的CD14 mRNA表达明显高于CC纯合子。伤后第7天，TC基因型血浆sCD14浓度高于CC基因型，其余时间点各个基因型之间差异不大。（7）CD14一159TT纯合子的TNF一amRNA表达量明显高于CC纯合子。与CD14C一159T基因多态性有关。烧伤患者血浆LBP水平也伤后第3、21天因纯合子血浆LBP浓度明显高于C等位基因纯合子。T等位基且TT和TC两种基因型与CC纯合子相比，LBP浓度出现峰值时间早，下降则较为缓慢。（8）白细胞TNF一a及CD 14 mRNA表达与烧伤患者预后密切相关。血浆sCD14和LBP浓度对烧伤患者预后也有一定影响。（9）临床观察中，重度烧伤组中3例出现脓毒其中2例基因型为TT，另一例基因型为TC;特重烧伤组4例TT纯合子中有3例发生MODS，且均未存活，10例症中TC杂合子中6例发展为MODS，死亡4例，而2例CC纯合子均未发生MODS。结论:（l）LBPPhe436Leu基因多态性与LPS刺激全血细胞炎症介质生成无关，与烧伤后脓毒症易感性及预后相关不明显。军医进修学院硕士论文 （2）CD14C一159T基因多态性与CD14 mRNA的表达、SCD14浓度及炎症介质的生成量有关。尤为重要的是，CD14C一159T基因多态性可能与个体对脓毒症及MODS的易感性有关，TT基因型可能是患者预后不良的高危基因标志物。（3）CD]4C一159T与LBp phe436Leu基因多态性之间不存在连锁不平衡，CD 14C一159T基因多态性可能通过IL一6的网络效应，间接影响LBP浓度。但LBP Phe436Leu基因多态性对CD14的表达没有影响。