胰液中相关基因高甲基化检测在胰腺疾病诊断中的应用研究前言胰腺癌是二十一世纪人类面临的高度恶性肿瘤之一，在北美洲和欧洲分别占癌症死亡原因的第四位和第六位，在日本占第五位，在我国为前10位。90％的胰腺癌患者在诊断后一年内死亡，诊断后平均生存时间为三个月，适合手术者低于15％，手术平均切除病例的术后5年生存率低于4％。与胃结肠肿瘤不同，因胰腺的解剖结构特点，对胰腺肿瘤活检病理诊断比较困难。近年来，影像学技术的发展提高了胰腺癌的检出率，但是对胰腺癌特别是微小胰腺癌诊断的特异性尚不尽人意。胰液的细胞学诊断曾被用于胰腺癌的诊断，但在细胞形态学上区分肿瘤细胞或炎症细胞亦比较困难，其准确性较低。胰液与血清相比含有高浓度的胰腺癌释放的DNA和蛋白质，被视为分子标志物的可靠来源，通过检测胰液中可能存在的分子生物学标志物用于胰腺癌辅助诊断越来越受到重视。在细胞形态学和相关辅助检查诊断胰腺癌困难，为了尽量较少繁杂的非必要检查或侵袭性的检查，应用分子生物学方法检测可能存在于患者胰液中遗传学和表观遗传学的改变，可能为胰腺癌诊断提供新依据。因此寻找并检出可能存在于胰液、胰腺灌洗液和十二指肠液中的特异性肿瘤标志物可能对胰腺癌诊断具有重要的临床意义。肿瘤的发生是多基因遗传学和表观遗传学共同作用的结果。胰腺癌表现为多基因不断累积的获得性突变的发展过程。包括染色体异常、原癌基因激活或过度表达、抑癌基因失活、DNA修复基因异常以及端粒酶、凋亡因子、血管生成因子和组织金属蛋白酶等异常在内的诸多因素导致了正常胰腺上皮发展为浸润性胰腺癌。表观遗传学主要包括DNA甲基化、染色质组蛋白的修饰（乙酰化、甲基化、磷酸化等）及基因印迹等。越来越多的证据表明多种表观遗传学机制在不改变原始DNA序列的前提下参与肿瘤的发生、发展。对肿瘤发生发展过程中表观遗传学机制的深入研究，为肿瘤转移的早期诊断和治疗提供了一个崭新的途径。胰腺癌基因甲基化异常广泛而又复杂，约60％的胰腺癌存在基因常甲基化引起的多基因失活和沉默，报告了包括p16，RASSF1A，cyclin D2，SOCS-1，RAR-β，APC等多基因启动子区CpG岛频繁异常甲基化。研究发现部分相关基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌细胞中广泛存在，而正常胰腺腺管上皮组织几乎不存在，具有高度肿瘤特异性。最近，胰液中ppENK、SARP2、NPTX2、CLDN5、TFPI-2等基因启动子区CpG岛甲基化相继被报告具有高度敏感性和特异性，可作为分子生物学肿瘤标志物用于胰腺癌的辅助诊断。最近的研究表明在定性检测肿瘤相关基因高甲基化的基础上，应用定量的方法，通过量化甲基化程度，进一步区分良恶性胰腺疾病，可提高诊断的准确性和特异性。Watanabe等证明，用定量的方法检测了SARP2基因在胰液中的高甲基化可提高胰腺癌诊断的敏感性，有较高的临床应用价值。Matsubayashi等的通过定量的方法检测了胰液中Cyclin D2、FOXE1、NPTX2、ppENK、p16和TFP12基因高甲基化的情况，认为定量方法检测肿瘤相关基因高甲基化用于诊断胰腺癌优于定性方法，具有很高的临床应用价值。本研究拟采用甲基化特异性聚合酶链式反应（MSP）和实时定量MSP方法，在定性诊断的同时应用定量方法评价NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺疾病鉴别诊断中的临床应用价值。一、人胰腺癌细胞系9株人胰腺癌细胞系KLM1，MiaPaCa2，Panc1，PK45H，PK59，PK1，PK8，PK9，BxPC3被用于本研究，分别生长于含10％胎牛血清的PRMI1640和DMEM培养液中，在37℃5％CO₂饱和湿度培养箱内传代。以上细胞系均来自金泽大学肿瘤研究所肿瘤内科实验室。二、临床标本临床标本来自日本金泽大学肿瘤研究所肿瘤内科1995—2005年住院患者共80例。其中，胰腺癌（PCa）37例，男性28例，女性9例，年龄范围从32岁到86岁；慢性胰腺炎（CP）25例，男性16例，女性9例，年龄范围从29岁到76岁：胰管内乳头状粘液瘤（IPMN）18例，男性12例，女性6例，年龄范围从54岁到79岁。胰腺癌病例中肿瘤位于胰头部18例，体尾部19例。16例经术后病理或超声内镜活检病理诊断为胰腺癌，21例经超声、超声内镜、CT、ERCP、肿瘤标志物等检查并经诊断为胰腺癌，并在诊断后3～30个月后因胰腺癌死亡。TNM分期根据1997年第5版UICC分期标准。Ⅰ期2例，Ⅱ期1例，Ⅲ期8例，Ⅳ期26例。肿瘤大小划分根据日本胰脏学会标准（1996），TS1（肿瘤直径≤2cm）4例，TS2（2cm＜肿瘤直径≤4cm）15例，TS3（4cm＜肿瘤直径≤6cm）15例，TS4（6cm＜肿瘤直径）3例。根据the Armed Forces Institute of Pathology标准，经多种临床检查或经术后病理检查，18例患者被诊断为IPMN，并进一步分为良性组和恶性组。其中，恶性组至少满足下列条件之一：1)主胰管的直径大于7mm；2)囊性结节30mm；3)囊壁结节大于6mm；4)交界性病变或腺癌未经外科术后病理证实。良性组为未满足上述条件的病变，或者术后病理证实为不典型增生和腺瘤。按上述标准，10例患者被诊断为恶性组，8例被诊断为良性组。根据日本胰脏学会标准（1997），25例患者被诊断为胰腺炎，并经12个月随访未发现胰腺新生肿瘤。三、标本收集及提取基因组DNA在内窥镜逆行胰胆管造影（ERCP）检查的同时收集患者胰液约10ml，-80℃保存备用。苯酚氯仿方法分别提取胰腺癌细胞系和胰液基因组DNA，乙醇沉淀。DNA浓度根据紫外分光光度计260nm吸光度确定，并根据260nm：280hm吸光度比值确认DNA纯度。提取DNA保存于-80℃备用。四、MSP（一） DNA处理取约1μg胰液基因组DNA，65℃重亚硫酸盐处理12-16hs（CpGennome DNA Modification Kit，Intergen，，USA）处理基因组DNA（具体方法按说明操作），保存于-80℃备用；（二） PCR分别使用基因NPTX2、CLDN5、ppENK各自甲基化和非甲基化对应引物行PCR扩增。反应体系包括重亚硫酸盐处理后模板DNA 2μl，CLDN5、NPTX2和ppENK相应的甲基化和非甲基化特异性引物，MgCl2、10xPCR缓冲液、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶（Ampli Taq Enzyme，Roche，USA）等，总反应体系25μl。扩增条件为95℃变性10min；94℃变性1min，分别61℃～64℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环。（三）电泳PCR产物10μl 3％琼脂糖凝胶电泳，SYBR Gold核酸染料，紫外灯下照相。五、实时定量MSP（一）实时定量MSP分别使用基因NPTX2、CLDN5、ppENK各自甲基化和非甲基化对应引物行实时定量PCR扩增，MYOD1基因作为管家基因用于本研究，NPTX2引物为自行设计。反应体系包括重亚硫酸盐处理后模板DNA 2μl，CLDN5、NPTX2和ppENK相应的甲基化和非甲基化特异性引物，应用LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Kit（Roche，Genmany）（按说明书操作），总反应体系10μl。扩增条件为95℃变性10min；95℃变性10s，分别61℃～64℃退火10s，72℃延伸12s,共45个循环。定量的荧光信号由SYBR Green I非特异性结合DNA双链产生，并由实时定量PCR仪自动记录。（二）构建标准曲线及溶解曲线采用特异性MSP产物cDNA作梯度稀释，稀释倍数10⁵～10⁹，构建标准曲线。通过荧光信号与每次扩增一一对应关系，实现对产物进行定量。通过构建溶解曲线，确定特异性产物的Tm值，进而排除非特异性产物的影响。六、统计学分析计数资料应用SPSS11.0软件行x²检验或Fisher精确概率法，P＜0.05差异有显著统计学意义。计量资料应用SPSS11.0软件行t检验，检验不同胰腺疾病胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因高甲基化值与管家基因MYOD1的比值，所有数据以均值±标准差的形式表示，P＜0.05差异有显著统计学意义。一、胰腺癌细胞系CLDN5、NPTX2和ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化检测MSP方法证实9株胰腺癌细胞系中均普遍存在CLDN5、NPTX2和ppENK启动子区CpG岛存在高甲基化。其中，KLM1和PK8胰腺癌细胞系NPTX2启动子区CpG岛表现为不完全的甲基化；KLM1和PK45H胰腺癌细胞系CLDN5启动子区CpG岛表现为不完全的甲基化；KLM1、Panc1和BxPC3胰腺癌细胞系ppENK启动子区CpG岛表现为不完全的甲基化，空白对照组（蒸馏水）均为阴性。证实CLDN5、NPTX2和ppENK基因启动子区高甲基化广泛存在于胰腺癌细胞系中，部分胰腺癌细胞系表现为不完全甲基化。二、胰液中CLDN5、NPTX2和ppENK基因CpG岛高甲基化检测MSP方法证实，在37例胰腺癌患者的胰液中，分别有23例、27例、18例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。25例慢性胰腺炎患者的胰液中，分别由6例、3例、4例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。18例IPMN患者胰液中，分别有8例、8例、7例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。8例IPMN良性组患者胰液中，各有2例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。10例IPMN恶性组患者胰液中，分别有7例、7例、5例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性基因。NPTX2基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.003）；胰腺癌与IPMN间存在显著差异（P=0.023）；IPMN恶性组与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.02）。提示NPTX2基因高甲基化不仅可以作为区分胰腺癌与慢性胰腺炎的分子生物学指标，尚可用于辅助鉴别诊断胰腺癌与IPMN、IPMN恶性组与慢性胰腺炎。在从胰腺炎、IPMN至胰腺癌的进程中，NPTX2基因高甲基化阳性率逐渐加深，提示NPTX2基因可能参与胰腺癌进展，其高甲基化导致的基因沉默可能是导致胰腺癌的原因之一。CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.000）；胰腺癌与IPMN间存在显著差异（P=0.002）；IPMN与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.042）。提示CLDN5基因高甲基化不仅可以作为区分胰腺癌与慢性胰腺炎的分子生物学指标，亦可用于辅助鉴别诊断胰腺癌与IPMN、IPMN与慢性胰腺炎。在从胰腺炎、IPMN至胰腺癌的进程中，CLDN5基因高甲基化阳性率逐渐加深，且三者间均存在显著差异，提示CLDN5基因可能参与胰腺癌进展，其高甲基化导致的基因沉默可能是导致胰腺癌的原因之一。ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.008）。提示ppENK基因可作为分子生物学肿瘤标志物用于辅助诊断胰腺癌与慢性胰腺炎。在从胰腺炎、IPMN至胰腺癌的进程中，ppENK基因高甲基化阳性率逐渐加深，提示ppENK基因可能参与胰腺癌进展，其高甲基化导致的基因沉默可能是导致胰腺癌的原因之一。三、胰腺癌患者胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化与胰腺癌部位、大小和TNM期间的关系胰腺癌患者胰液中CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化胰头与胰体尾比差异显著（P=0.003）。NPTX2、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化与胰腺癌部位、大小和TNM期间无明显相关（P＞0.05）。说明上述三基因高甲基化阳性结果可能仅提示患胰腺癌，与胰腺癌的病理生物学行为无明显相关。2例Ⅰ期且肿瘤大小均小于2cm患者胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK启动子区CpG岛高甲基化均阳性，在胰腺癌早期阶段胰液中即可检出上述三基因高甲基化，提示临床检测三者高甲基化对早期胰腺癌的诊断可能有一定的临床意义。四、实时定量MSP方法构建NPTX2、CLDN5、ppENK基因高甲基化产物溶解曲线分析实时定量MSP方法构建NPTX2、CLDN5、ppENK、MYODl溶解曲线：NPTX2的Tm值约84.3℃；CLDN5的Tm值约85.3℃；ppENK的Tm值约88.5℃；MYOD1的Tm值约80.0℃，根据特异性产物溶解曲线Tm值，排除可能干扰结果判定的非特异性的PCR产物，可提高PCR的特异性。五、实时定量MSP方法检测胰液中CLDN5、NPTX2和PPENK基因CpG岛高甲基化通过实时定量MSP方法，以特异性的MSP产物为标准品，10⁵—10⁹梯度稀释标准品，构建特异性PCR产物的标准曲线，通过标准曲线，进一步定量各标本相关基因启动子区CpG岛高甲基化量。NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化的量与MYOD1量的比值即上述三基因高甲基化在胰液中的相对量。在胰腺癌、IPMN组、IPMN恶性组、IPMN良性组和慢性胰腺炎患者胰液中，NPTX2基因启动子区CpG岛高甲基化水平分别为5.48±10.91、10.65±25.71、19.07±32.73、0.12±9.35和0.86±1.66(X10^-3)；CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化水平分别为3.52±7.28、1.66+3.16、2.50±4.02、0.60±1.08、0.26+0.58(X10^-3)；ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化水平分别为1.61±2.36、1.35+1.86、1.58±2.14、1.07±1.55和0.63±1.03（X10（-3））。NPTX2基因启动子区CpG岛高甲基化程度在胰腺癌和慢性胰腺炎（P=0.04）、IPMN和慢性胰腺炎（P=0.000）间存在显著差异。CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化程度胰腺癌和慢性胰腺炎（P=0.03）、IPMN和慢性胰腺炎（P=0.004）间亦存在显著差异。ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化程度在胰腺良恶性疾病间差异不显著（P＞0.05）。提示实时定量方法检测NPTX2和CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化程度可用于胰腺良恶性疾病的鉴别诊断。此外，胰腺癌患者胰液中7例（18.9％）NPTX2基因、9例（24.3％）CLDN5基因高甲基化程度远高于慢性胰腺炎患者甲基化值上限，提示实时定量MSP方法比定性方法在辅助诊断胰腺癌方面更有价值。进而我们设定了合适的Cut Off值判定NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区高甲基化程度，三者分别为1.0×10^-3、0.65×10^-3、0.7×10^-3，这样通过实时定量MSP方法，在37例胰腺癌患者的胰液中，各有20例（54.1％）NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化阳性。25例慢性胰腺炎患者的胰液中，NPTX2基因CpG岛高甲基化阳性5例（20.0％）；CLDN5基因CpG岛高甲基化阳性2例（8.0％）；ppENK基因CpG岛高甲基化阳性7例（28.0％）。8例IPMN良性组患者胰液中，0例（0.0％）NPTX2基因CpG岛高甲基化阳性；2例（25.0％）CLDN5基因CpG岛高甲基化阳性；3例（37.5％）ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。10例IPMN恶性组患者胰液中4例（40％）NPTX2基因CpG岛高甲基化阳性；6例（60％）CLDN5CpG岛高甲基化阳性；6例（60％）ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。NPTX2基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.007）；胰腺癌与IPMN间存在显著差异（P=0.026）CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.000）；IPMN与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.009）。ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异（P=0.042）。NPTX2基因，含4个外显子，编码46.8KD的430个氨基酸的蛋白质。在人脑、睾丸、胰腺、肝脏、心脏、骨骼肌等处表达。与细胞外物质的吸收相关，可能通过与细菌和细胞碎片结合，参与炎症和免疫反应。在胰腺癌组织，其启动子领域CpG岛高度甲基化，文献报道达98％。CLDN5基因属于与紧密连接相关的Claudins蛋白家族，通过限制上皮细胞和内皮细胞旁孔隙的分子大小调节相关器官如血脑屏障的通透性。编码分子量为23KD 219个氨基酸的跨膜蛋白。在血管、脑、肺生殖系统高表达，胰腺内分泌细胞和肾脏等出中等程度表达。具有调节血脑屏障通透性的功能。有报告在乳腺癌和Paget’s病细胞膜上表达，在肿瘤发生中的功能尚不明了，在胰腺癌中其启动子领域CpG岛高度甲基化，文献报道达82％。ppENK基因属于阿片神经肽前体家族，位于染色体8q11.23-q12，具有2个外显子编码30KD 267个氨基酸的蛋氨酸脑啡肽，与阿片生长因子受体作用发挥抑制因子的作用，抑制多种肿瘤的生长。在多种肿瘤中启动子领域甲基化CpG岛高度甲基化使其失活，在肿瘤发生中可能有促进肿瘤细胞生长的左右。在胰腺癌中其启动子领域CpG甲基化达90％以上。胰腺癌的基因甲基化异常广泛而又复杂，约60％的胰腺癌组织存在基因高甲基化引起的多基因失活和沉默，除上述三基因外，还包括p16、hMLH1、RASSF1A、ppENK、TFPI-2等基因的高甲基化相继被证实普遍存在于胰腺癌细胞中，并可能在胰腺癌进程中具有重要的作用。Klump等的研究表明在胰腺癌中p16INK4a和p14ARF抑癌基因的敏感度虽然仅43％，但是特异性达到100％，明显优于现有的影像学和实验室标志物，甚至细胞学的诊断。Sato等对NPTX2、SARP2和CLDN5基因的甲基化进行分析，显示在全部43例原发性胰腺癌和24例中的18例胰腺癌患者胰液中至少一个基因的甲基化被检出。本研究应用MSP方法证实9株胰腺癌细胞系中均普遍存在CLDN5、NPTX2和ppENK启动子区CpG岛存在高甲基化。其中，KLM1和PK8胰腺癌细胞系NPTX2启动子区CpG岛表现为不完全的甲基化；KLM1和PK45H胰腺癌细胞系CLDN5启动子区CpG岛表现为不完全的甲基化；KLM1、Panc1和BxPC3胰腺癌细胞系ppENK启动子区CpG岛表现为不完全的甲基化，空白对照组（蒸馏水）均为阴性。证实在胰腺癌细胞中普遍存在CLDN5、NPTX2和ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化，可能是胰腺癌进程中的普遍现象，部分胰腺癌细胞系表现为不完全甲基化提示相关基因启动子区CpG岛高甲基化在不同克隆的胰腺癌细胞中的程度存在差异。最近，通过MSP的方法检测胰液中可能存在的肿瘤相关基因启动子区CpG岛的高甲基化被证实具有高度特异性和敏感性，可能成为胰腺癌诊断的特异性标志物。Fukushima等证实，在66.7％（30／45）的胰腺癌患者的胰液存在ppENK基因的高甲基化]。Sato等证明67％（16／24）、46％（／1124）和42％（10／24）的胰腺癌患者胰液中分别存在NPTX2、SARP2及CLDN5的高甲基化，且13例慢性胰腺炎患者的胰液中均未检出三者的高甲基化。本研究应用MSP方法证实，在37例胰腺癌患者的胰液中，分别有23例、27例、18例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。25例慢性胰腺炎患者的胰液中，分别由6例、3例、4例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。18例IPMN患者胰液中，分别有8例、8例、7例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。8例IPMN良性组患者胰液中，各有2例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。10例IPMN恶性组患者胰液中，分别有7例、7例、5例表现为NPTX2、CLDN5、ppENK基因CpG岛高甲基化阳性基因。胰液中三基因基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间均存在显著差异，提示三基因特异性及敏感性均较高，可能作为肿瘤标志物用于临床上辅助鉴别诊断胰腺癌和慢性胰腺炎。从慢性胰腺炎、IPMN到胰腺癌胰液中三基因甲基化阳性率增加，且NPTX2基因高甲基化在胰腺癌与IPMN间、IPMN恶性组与慢性胰腺炎间差异显著，CLDN5基因高甲基化在胰腺癌与IPMN间、IPMN与慢性胰腺炎间差异显著，提示三者可能通过甲基化引起的基因沉默在从正常胰腺上皮到胰腺癌的进程中发挥作用。并且，NPTX2基因高甲基化检测可用于辅助鉴别诊断胰腺癌与IPMN、IPMN恶性组与慢性胰腺炎。CLDN5基因高甲基化可用于辅助鉴别诊断胰腺癌与IPMN，IPMN与慢性胰腺炎。与ppENK基因相比，胰液中NPTX2与CLDN5基因高甲基化特异性更高。胰腺癌患者胰液中CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化胰头与胰体尾比差异显著，提示不同部位胰腺癌CLDN5基因高甲基化检出的敏感度不同，对于胰体尾肿瘤CLDN5可能是更好的肿瘤标志物。而胰液中NPTX2和ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化与胰腺癌部位、大小和TNM期间则无明显相关，提示上述两基因可能仅是胰腺癌进程中的普遍现象，参与胰腺癌进程，与胰腺癌的生物学行为相关性不大。此外本研究中，2例Ⅰ期且肿瘤大小均小于2cm患者胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化均阳性，说明上述基因高甲基化的检测敏感、特异，在胰腺癌早期阶段即可在胰液中检出三基因高价计划，对诊断早期胰腺癌具有较高的临床应用价值。最近在定性的MSP检测的基础上，陆续报告了应用实时定量的MSP检测不同肿瘤的体液组织中肿瘤相关基因启动子区CpG岛高甲基化的情况，如前列腺癌、乳腺癌等，认为定量方法具有更高的敏感性，通过设定合适的cutoff值能有效提高检测的特异性，更能反映肿瘤相关基因高甲基化的水平，在肿瘤的诊断中具有一定的应用价值。Yan等报告应实时定量MSP方法在胰腺癌中检测到高水平p16（INK4a）启动子区甲基化，而在胰腺炎组织中水平极低，提示肿瘤相关基因高甲基化作为胰腺癌肿瘤标志物有较好的应用前景。本研究在定性MSP的基础上进一步应用实时定量MSP方法检测了NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化程度。通过实时定量MSP的方法通过Tm值排除非特异产物的影响，提高检测的特异性。进而通过不同稀释倍数的标准品构建标准曲线，准确定量肿瘤相关基因高甲基化水平，通过与内对照MYOD1的比值，更能真实反映胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因高甲基化的程度。在此基础上设定合适的CutOff，进一步提高检测的可靠性。本研究应用实时定量MSP方法证明NPTX2基因启动子区CpG岛高甲基化程度胰腺癌和慢性胰腺炎、IPMN恶性组和慢性胰腺炎间存在显著差异。CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化程度胰腺癌和慢性胰腺炎、IPMN恶性组和慢性胰腺炎间亦存在显著差异。而ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化程度在胰腺良恶性疾病间差异不显著。提示实时定量MSP方法检测NPTX2和CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化程度可用于辅助胰腺疾病的鉴别诊断。另一方面在胰腺癌进展中不同基因高甲基化水平可能不同，应用实时定量MSP方法检测胰腺癌相关基因高甲基化程度的结果可能更能反映此基因参与胰腺癌进程的真实情况。通过实时定量MSP的方法我们发现从慢性胰腺炎、IPMN到胰腺癌，NPTX2、CLDN5和ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化的基因数量与程度均增加，提示多个相关基因不同程度的高甲基化可能是胰腺癌进程中的重要表观遗传学机制。通过设定相应的CutOff值，应用实时定量MSP方法，在37例胰腺癌患者的胰液中，20例NPTX2基因启动子区CpG岛高甲基化阳性；20例CLDN5基因CpG岛高甲基化阳性；20例ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。25例慢性胰腺炎患者的胰液中，NPTX2基因CpG岛高甲基化阳性5例；CLDN5基因CpG岛高甲基化阳性2例；ppENK基因CpG岛高甲基化阳性7例。8例IPMN良性组患者胰液中，0例NPTX2基因CpG岛高甲基化阳性；2例CLDN5基因CpG岛高甲基化阳性；3例ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。10例IPMN恶性组患者胰液中4例NPTX2基因CpG岛高甲基化阳性；6例CLDN5基因CpG岛高甲基化阳性；6例ppENK基因CpG岛高甲基化阳性。NPTX2基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异；胰腺癌与IPMN间存在显著差异。CLDN5基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异；IPMN与慢性胰腺炎间存在显著差异。ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化在胰腺癌与慢性胰腺炎间存在显著差异。提示实时定量MSP的方法检测胰液中胰腺癌相关基因高甲基化水平不但敏感性更高，进而通过设定合适的CutOff值，提高检测的特异性，用于辅助胰腺疾病的鉴别诊断在临床上有较好的应用前景，当然合理的CutOff值设定尚需大样本的临床研究。实时定量MSP与MSP相比，通过真实记录相关基因高甲基化水平，更能真实的反映相关基因高甲基化参与胰腺癌进展的程度。其中胰腺癌患者胰液中7例（18.9％）NPTX2基因、9例（24.3％） CLDN5基因高甲基化程度远高于慢性胰腺炎患者胰液相应基因高甲基化值上限，提示实时定量MSP比定性的MSP在最终确定诊断胰腺癌方面更具临床应用前景。一、MSP方法检测胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化作为胰腺癌肿瘤标志物特异性及敏感性均较高，可用于临床辅助诊断良恶性胰腺疾病。二、MSP方法检测胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化提示三基因不同程度参与胰腺癌进程。三、MSP方法检测NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化对早期胰腺癌的辅助诊断可能具有较高的临床应用价值。四、实时定量MSP方法检测胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化敏感性、特异性均较高，可作为临床诊断胰腺癌的辅助手段。五、实时定量MSP方法证实NPTX2、CLDN5、ppENK基因不同水平的启动子区CpG岛高甲基化可能是胰腺癌进程中的重要表观遗传学机制。六、应用实时定量MSP的方法检测胰液中NPTX2、CLDN5、ppENK基因启动子区CpG岛高甲基化，通过合理设定CutOff值，更有助于胰腺疾病的诊断，比定性的MSP方法更具临床应用前景。