研究背景近年来,随着经济社会的迅速发展,空气、水、饮食等环境污染日趋严重,人们生活方式和生活习惯逐渐改变,工作压力大、人工与药物流产以及晚婚晚育、绝育术后等,导致不同程度的影响了人类生育能力。由于生育能力下降,不孕症发生率日趋增高,已成为全球性健康和社会公共难题。20世纪80年代末期世界卫生组织的33个研究中心对25个国家的不孕症夫妇组织了一次采用标准化诊断的调查,结果显示在发达国家约有5-8%的夫妇受到不孕症的影响,而发展中国家一些地区可高达30%不孕症的发病率。我国各省市的发病率相差亦较大,最低约4%,最高约19%,平均约10-15%,已经成为继心脑血管疾病、癌症之后的第三大疾病。随着我国二胎政策的放开,人们对生育也有了新的要求,不孕症的人数会进一步大幅度增加,并且我国大部分地区不孕不育治疗不在医保报销范围,因此不孕夫妇承受着巨大的经济和心理压力。上世纪生殖医学及辅助生殖技术的逐渐兴起,为不孕夫妇治疗带来新的希望,主要依据生殖内分泌理论指导人类辅助生殖技术,人工操作配子、合子以及胚胎,从而完成受孕过程,全称为人工方法辅助完成自然过程。体外受精-胚胎移植技术(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer, IVF-ET)的发明和应用为成功解决全球不孕不育患者的痛苦提供了希望,为全球公共社会问题的解决提供了有利途径。体外受精-胚胎移植受较多因素影响,存在一定的局限和风险。尽管有不断发明的新型有效的促排卵药物的应用,监测排卵技术及取卵技术的进步,新型培养仪器、试剂应用,实验室条件下获得的卵母细胞数量增加质量不断优化,受精率及胚胎卵裂率、优质胚胎率逐步提高,但是体外受精-胚胎移植妊娠结局是受许多因素包括遗传因素和每个周期的妊娠率的综合影响,因此成功几率仅保持在30%左右,与患者和医务人员的希望还有很大差距,也是辅助生殖技术专家努力的方向。近年来,随着分子生物学技术的发展,分子生物标志物作为快速、成本效益高和敏感的诊断工具,用于预测体外受精-胚胎移植的结果有很大的潜力,但迄今为止据我们查找的文献尚未有在IVF-ET中相关研究报道。现今高通量测序技术的优势得以体现,疾病研究的原有模式被打破并得以取得重大突破,实现了大规模、以数据为主导的工业化研究模式,为疾病的深入研究、提高疾病的探索效率提供了极大的方便,突破以往人们对疾病探索领域,可以为疾病病因学、发病机制以及预防、诊断、治疗的研究提供更为有效的手段。RNA-seq即转录组测序技术,又被称为全转录组鸟枪法测序,RNA-seq技术的开发被称为转录组学测序的革命性进展。RNA-seq可以把mRNA、小RNA以及non-coding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来,反映出它们的表达水平。因此可用于检测和分析样品中儿乎所有的RNA成分,为各种疾病的探索提供了新的无限价值的工具。在本研究中,我们利用基因表达分析技术联合HiSeqTM 2000测序系统在10例接受IVF-ET不孕患者中进行检测研究,分为三个阶段检测,分别为进行体外受精-胚胎移植前阶段,阶段Ⅰ(StageⅠ);卵巢刺激启动阶段,阶段Ⅱ(StageⅡ);胚胎移植后15天,阶段Ⅲ(Stage Ⅲ)。10例患者妊娠结局为5例妊娠成功,5例妊娠失败。先进行RNA提取,RNA-seq实验、分析,然后利用FastQC package进行原始数据的分析后选出敏感基因,再利用实时定量PCR (qRT-PCR)进行验证的几个检测出差异表达基因的表达水平,并分析相关影响体外受精-胚胎移植妊娠结局的分子机制。此外,确定相关基因可能辅助检测ⅣF-ET患者妊娠预后,寻找新型的潜在生物标志物。研究方法本研究选取的研究对象为2014年1月至2014年6月在人理人学第一附属医院生殖医学科进行体外受精-胚胎移植的不孕患者,共计10例患者入选本研究。依据体外受精-胚胎移植治疗的妊娠结局分为两组,分别为妊娠成功组(pregnancy success group,或简称preg group),以及妊娠失败组(pregnancy failure group,或简称nopreg group),每组各5例患者。对入选患者的所有相关临床资料进行记录,包括年龄、身高、体重等一般资料,以及其他疾病、服药史、家族史等。将妊娠成功组和妊娠失败组两组患者的样本收集分为三个阶段,分别为进行IVF-ET前阶段,阶段Ⅰ(Stage Ⅰ);卵巢刺激启动阶段,阶段Ⅱ(Stage Ⅱ);胚胎移植后15天,阶段Ⅲ(Stage Ⅲ)。卵巢刺激方案应用标准长方案进行控制性超促排卵,阴道超声监测卵泡发育,卵泡成熟在阴道超声引导下进行穿刺取卵,行常规体外授精,18小时后受精检查,然后进行胚胎分级和碎片评估选择优质胚胎进行胚胎移植,在胚胎移植后15d,通过血清中P-hCG检测妊娠成功与否,分别检测其峰值变化和滴度改变。妊娠35天在阴道超声检测胎心活动和孕囊。RNA提取、RNA-seq测序后对原始序列数据进行处理,生物信息学分析包括利用FastQC package进行原始数据的分析、基因表达注释、差异表达基因分析、差异基因表达模式聚类分析以及GO (Gene Ontology)功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析,Real time PCR验证差异表达基因。分析相关影响体外受精-胚胎移植妊娠结局的分子机制,并确定相关基因可能辅助检测IVF-ET患者妊娠预后,寻找新型的潜在生物标志物。结果1妊娠成功组(preg group)和妊娠失败组(nonpreg group)两组一般临床资料年龄、不孕年限、BMI、FSF/LH比值、血清E2水平、血清T水平等无统计学差异(P>0.05)。2妊娠成功组(preg group)收集卵母细胞62个,成熟卵母细胞52个；妊娠失败组(nonpreg group)收集卵母细胞64个,成熟卵母细胞55个；两组成熟卵形成率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3两组Gn天数,启动FSH剂量,Gn总量,移植胚胎数,2PN受精率,优质胚胎率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4 在IVF-ET前阶段,阶段I(Stage I)中,妊娠成功组总计收集11698976 clean reads,占原始数据总数的98.62%;妊娠失败组总计收集26502828 clean reads,占原始数据总数的98.4%。卵巢刺激启动阶段,阶段Ⅱ(Stage Ⅱ),妊娠成功组总计收集3175521 clean reads,占原始数据总数的98.55%；妊娠失败组总计收集12139689 clean reads,占原始数据总数的98.37%。胚胎移植后15天,阶段Ⅲ(Stage Ⅲ),妊娠成功组总计收集10769344 clean reads,占原始数据总数的98.62%；妊娠失败组总计收集17021605 clean reads,占原始数据总数的98.51%。5在IVF-ET前阶段Ⅰ(Stage Ⅰ),妊娠成功组和妊娠失败组分布在参考数据库中基因分别为45.43%和50.14%;卵巢刺激启动阶段,阶段Ⅱ(StageⅡ),妊娠成功组和妊娠失败组分布在参考数据库中基因分别为50.17%和50.34%；胚胎移植后15天,阶段Ⅲ (Stage Ⅲ),妊娠成功组和妊娠失败组分布在参考数据库中基因分别为48.72%和53.24%。6在三个不同阶段中,和参考数据库对比后,两组研究对象中每个样本中约有28-38% 100 bp长度的配对clean reads可达到至少90%-100%基因覆盖率。主要基因类型的转录mRNAs表达量低,而仅有少数基因表达量较高。7经PCA分析(主成分分析)结果显示,妊娠失败组和妊娠成功组在IVF-ET前阶段、阶段Ⅰ(Stage Ⅰ)和卵巢刺激启动阶段、阶段Ⅱ(Stage Ⅱ)具有相似的特征。但是在第三阶段,胚胎移植后15天,阶段Ⅲ (Stage Ⅲ)与其他阶段具有显著性差异(P<0.05)。8 IVF-ET前阶段、阶段Ⅰ,卵巢刺激启动阶段、阶段Ⅱ,胚胎移植后15天、阶段Ⅲ中分别共计检测了282,208和372个差异表达基因。结果可见,阶段Ⅰ中,共有130个基因表达上调,152个基因表达下调；而在阶段Ⅱ中,共有90个基因表达上调,118个基因表达下调；而在阶段Ⅲ中,共有100个基因表达上调,272个基因表达下调。9 RPKM值散点图确定存三个阶段中,仅有极少的一部分基因是差异表达基因。10在阶段Ⅰ,IVF-ET前阶段,“剧期性进程”("rhythmic process")和“蛋白标签”("protein tag")相关基因表达上调,“电子载体活性’("electron carrier activity")相关基因表达下调。阶段Ⅱ,卵巢刺激启动阶段,“突触部分”("synapse part")、“突触”("synapse")、“结构分析活性”("structural molecule activity")、“抗氧化活性”("antioxidant activity")相关基因都表达下调。阶段Ⅲ,胚胎移植后15大,周期性进程”("rhythmic process")、“突触部分”("synapse part")、“突触”("synapse")、‘排除活性”("chemorepellent activity")相关基因都表达下调。11在阶段Ⅰ,IVF-ET前阶段的所有差异表达基因中,282个差异表达基因分属于23条显著富集的通路(P<0.05)。阶段Ⅱ,卵巢刺激启动阶段,208个差异表达基因分属于32条显著富集的富集通路(P<0.05)。阶段Ⅲ,胚胎移植后15天,372个差异表达基因分属于17条显著富集的富集通路(P<0.05)。12在阶段Ⅰ,IVF-ET前阶段,“趋化因子信号通路”("chemokine signaling pathway")和“细胞粘附分子通路”("cell adhesion molecules pathways");阶段Ⅱ,卵巢刺激启动阶段,“趋化因子信号通路”("chemokine signaling pathway");阶段Ⅲ,胚胎移植后15天,“卵母细胞减数分裂”("oocyte meiosis")、’‘孕酮介导的卵母细胞成熟”("progesterone-mediated oocyte maturation" pathways)等显著富集。除此之外,多数差异表达基因和阶段Ⅰ中“趋化因子信号通路”("chemokine signaling pathway")、“细胞粘附分子通路”("cell adhesion molecules pathways"),以及阶段Ⅱ中“趋化因子-细胞因子受体相互作用信号通路”("cytokine-cytokine receptor interaction")、“趋化因子信号通路”("leishmariasis")、以及阶段Ⅲ中“细胞周期”("cell cycle")、“卵母细胞减数分裂”("oocyte meiosis")相关。13基于KEGG富集通路分析,选择主要组织相容性复合体-A (HLA-A)、白介素-1β (IL-1β)、主要组织相容性复合体-DQA1 (HLA-DQA1)、血红蛋白D(HBD)、微小染色体维持缺陷蛋白4(MCM4)等5个基因对妊娠结局影响最为重要。14在妊娠失败组,阶段Ⅱ中,HLA-A表达降低,而在阶段Ⅲ中表达急剧升高；而在妊娠成功组中,妊娠期间HLA-A表达逐渐降低,远低于妊娠失败组。妊娠失败组中,HLA-DQA1在妊娠持续期间表达增加；而在妊娠成功组中,表达持续降低,但表达量始终高于妊娠失败组。妊娠失败组中,IL-1β在妊娠持续期间表达增加；阶段Ⅰ中,妊娠成功组中IL-1β表达量显著高于妊娠失败组；在阶段Ⅱ中,IL-1β急剧下降,而在阶段Ⅲ中表达提高,但是仍旧低于妊娠失败组。妊娠失败组中,HBD在妊娠持续期间表达降低；在妊娠成功组中,HBD在阶段Ⅰ和阶段Ⅱ中始终维持较低水平,但是在阶段Ⅲ中表达量急剧增加,维持在较高的水平。妊娠失败组中,MCM4在阶段Ⅲ中表达量显著增加,而在妊娠成功组中增加并不明显。结论1本研究利用HiSeqTM 2000测序系统对影响人类IVF-ET妊娠结局的基因表达进行分析,证实在IVF-ET前阶段,即阶段Ⅰ(StageⅠ);卵巢刺激启动阶段,阶段Ⅱ(Stage Ⅱ);胚胎移植后15天,阶段Ⅲ (Stage Ⅲ)三个阶段的基因表达有显著差异。2基因表达改变和机体免疫应答、炎症、卵母细胞减数分裂等相关。3 HBD和MCM4可作为IVF-ET妊娠结局的分子标记物。4 HLA-A和HLA-DQAl与妊娠发育持续密切相关,提示HLA-A和HLA-DQAl也可作为妊娠预测的分子标记物。5本研究为进一步深入研究影响IVF-ET妊娠结局的分子机制提供了理论基础,并为临床进行IVF-ET的影响因素的研究以及预后分子靶标选择提供了新的研究方向和数据。