论文部分内容阅读
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种人兽共患的条件致病菌,宿主嗜性广泛,主要引起呼吸系统疾病、出血性败血症等。Pm根据荚膜抗原可分为A、B、D、E和F共5种血清型。其中牛源A型多杀性巴氏杆菌可引发牛呼吸道疾病综合征,感染后肺部器官病变显著,致死率极高,给养牛业带来巨大经济损失。本实验室前期研究发现,小鼠人工感染牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2后,小鼠肺部丝氨酸(Serine,Ser)、甘氨酸(Glycine,Gly)、谷氨酸(Glutamate,Glu)和半胱氨酸(Cysteine,Cys)等多种游离氨基酸显著下调,添加外源Ser可提高小鼠抗PmCQ2感染的能力。本研究通过构建PmCQ2巨噬细胞感染模型,发现感染后Ser等氨基酸变化显著,查阅文献发现谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是上述氨基酸作用的最终效应分子。为此,我们进一步在细胞和小鼠模型上研究了GSH对PmCQ2感染的影响。主要研究方法及结果如下:1 PmCQ2巨噬细胞感染模型的构建及胞内氨基酸的变化在PmCQ2感染巨噬细胞(MOI为1:1)的不同时间点,通过q RT-PCR检测核苷酸结合寡聚化结构域(Nucleotide binding oligomerization domain,NOD)样受体3(NLPR3)、白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)和活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的转录情况,结果显示它们的表达均随感染时间上调,证明PmCQ2感染巨噬细胞后诱导炎症反应。感染后胞内氨基酸变化与实验室前期PmCQ2感染肺组织的转录组结果基本一致,其中Ser、Gly、Glu和Cys显著下调。2感染PmCQ2对Ser代谢和GSH合成的影响提取感染PmCQ2的细胞总RNA,q RT-PCR检测Ser合成与代谢通路中关键酶的转录水平。发现关键合成酶的转录水平变化如下:与未感染组相比,磷酸丝氨酸磷酸酶(Psph)感染6 h和8 h后下调,双磷酸甘油酸突变酶(Bpgm)感染6 h、8 h和10 h后均下调,磷酸甘油酸酯突变酶1(Pgam1)感染4 h、6 h、8 h和10 h均下调,磷酸甘油酸脱氢酶(Pgdh)感染后无明显变化。相反与未感染组相比,关键代谢酶:丙氨酸-乙醛酸转氨酶(Agxt)感染6 h、8 h和10 h后均上调;胱硫醚β合成酶(Cbs)感染8 h和10 h后上调;丝氨酸羟甲基转移酶2(Shmt2)、甘氨酸酰胺基转移酶(Gatm)和丝氨酸消旋酶(Srr)感染6 h、8 h和10 h后也均上调;胍基乙酸盐N-甲基转移酶(Gamt)感染4 h和6 h后上调、8 h后无明显变化,而感染10 h后下调。ELISA验证Agxt、Cbs和Psph的表达水平,结果与转录水平基本一致,提示Ser代谢加快。ELISA检测发现,感染PmCQ2后不同时间点GSH含量下调。因此,我们猜测这是宿主调动Gly、Glu和Cys共同合成了GSH,并利用GSH来抵抗PmCQ2导致的氧化应激。3外源补充GSH通过Nrf2通路影响巨噬细胞的吞噬杀伤作用和细胞因子的表达我们发现外源补充1 m M、2 m M、3 m M和4 m M GSH中,2 m M时可降低PmCQ2的毒性作用。q RT-PCR结果显示,未补充GSH时巨噬细胞感染PmCQ2后Nrf2的表达无明显差异。而补充2 m M GSH后Nrf2的表达上调,ROS、IL-1β、IFN-γ、TNF-α和IL-6的表达下调。于是将GSH与Nrf2抗氧化通路联系起来。发现补充2 m M GSH后Nrf2通路的关键抗氧化因子:血红素加氧酶-1(HO-1)和超氧化物歧化酶(SOD)表达上调。GSH合成代谢限速酶包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶-催化亚基(Gclc)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶-调节亚基(Gclm)表达上调,提示补充2 m M GSH可能反馈激活Nrf2抗氧化通路。我们测定了补充2 m M和4 m M GSH对巨噬细胞吞噬和清除能力以及对炎性因子表达的影响,结果发现补充2 m M GSH可提高巨噬细胞的吞噬与清除能力,抑制IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6的表达,但补充4 m M GSH对巨噬细胞活性无明显影响。4补充GSH对PmCQ2生物学特性的影响本研究还测定了补充2 m M、3 m M和4 m M GSH对PmCQ2生长、生物膜和相关毒力基因的影响。结果发现,补充2 m M GSH对PmCQ2的生长和毒力相关基因Omp A和Ton B的表达有一定的抑制作用,可降低PmCQ2生物膜含量。补充4 m M GSH对PmCQ2的生长和毒力相关基因Pm0979和tbp A的表达有一定的促进作用,对PmCQ2生物膜含量无明显影响。5补充GSH对小鼠抗PmCQ2感染的影响以滴鼻、腹腔注射和灌胃三种方式探索GSH的动物实验最佳补充途径,将2m M和4 m M的细胞浓度分别换算为24.5 mg/kg和49 mg/kg的动物浓度。我们测定了小鼠肺脏湿重/干重(W/D)比率、生存曲线和肺部细菌定殖量。结果显示滴鼻补充24.5 mg/kg GSH组的小鼠最终存活一只;补充49 mg/kg GSH组和对照组小鼠均全部死亡,且前者死亡速度更快;通过腹腔注射和灌胃补充GSH组的小鼠,不管浓度高低,均和对照组一样全部死亡,且死亡速度无显著性差异。与健康小鼠肺脏相比,感染PmCQ2后肺部表观病理变化显著,部分存在积液;补充24.5 mg/kg GSH组病变程度较补充49 mg/kg GSH组轻微,且49 mg/kg GSH组PmCQ2肺部定殖密度更高。综上所述,本研究通过体外和体内补充GSH探究了其对PmCQ2感染的影响,发现外源补充2 m M GSH能反馈激活Nrf2抗氧化通路,促进Nrf2、GST、Gclc、Gclm、HO-1和SOD的表达,提高巨噬细胞的吞噬与清除能力,抑制IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌。24.5 mg/kg GSH能降低小鼠W/D比率和死亡率,49 mg/kg GSH能提高PmCQ2肺部定殖密度。