【摘 要】
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鞣花酸（Ellagic acid,EA）类化合物是一类在植物中分布广泛的天然产物,具有抗炎、抑菌、抗癌等活性,在药品、保健品、化妆品等领域应用广泛,全球每年市场达数亿美元。EA的生产目前主要依赖于植物提取法,其得率较低,无法满足市场需求。近年来,利用合成生物学方法生产天然产物的研究备受关注,过氧化物酶（Peroxidase,POD）由于底物谱广、催化效率高,已被应用到多种天然产物的生物合成中。本研
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鞣花酸（Ellagic acid,EA）类化合物是一类在植物中分布广泛的天然产物,具有抗炎、抑菌、抗癌等活性,在药品、保健品、化妆品等领域应用广泛,全球每年市场达数亿美元。EA的生产目前主要依赖于植物提取法,其得率较低,无法满足市场需求。近年来,利用合成生物学方法生产天然产物的研究备受关注,过氧化物酶（Peroxidase,POD）由于底物谱广、催化效率高,已被应用到多种天然产物的生物合成中。本研究通过筛选高效POD,在大肠杆菌中构建了利用POD催化没食子酸甲酯（Methyl gallate,MG）生成EA的途径。首先基于底物-产物结构类似性及酶的催化机理,筛选出6种POD并通过融合麦芽糖结合蛋白MBP成功提高了目的蛋白在大肠杆菌中的表达量和可溶性。随后以MG为底物进行体外酶活测定,发现来自Silybum marianum的抗坏血酸过氧化物酶APX1对MG具有最高的催化速率,kcat值为0.618±0.07 s-1。通过优化体外反应体系中H2O2的添加量,利用APX1催化MG生成了120.56 mg/L EA,得率为52%。通过优化p H,最终在体外反应中最佳p H为8.0的条件下,添加终浓度6 m M MG时,由APX1催化生成了755.79 mg/L EA,得率达到83%。在体外合成EA的研究基础上,我们将APX1转入到BL21（DE3）中用于以MG为底物的发酵实验,添加100 mg/L MG时得到了22.91 mg/L EA,成功实现了EA在大肠杆菌体内的首次生物合成。通过过表达hem A提高辅因子血红素供应、增加底物添加量、优化发酵条件等策略,最终将EA产量提高到213.55 mg/L,得率为57%,为大肠杆菌中EA的从头合成奠定基础,为后续的工业放大提供了理论依据。3,3’-二甲氧基鞣花酸作为EA衍生物的另一重要母核,与EA具有类似的结构和功能。本研究通过将筛选的高效POD用于催化4-O-甲基没食子酸甲酯,发现来自Armoracia rusticana的辣根过氧化物酶HRPO对底物催化活性最好。通过优化体外反应中H2O2添加量及反应p H,最终在p H为6.0的条件下,通过添加2 m M 4-O-甲基没食子酸甲酯,由HRPO催化生成了24.10 mg/L 3,3’-二甲氧基鞣花酸,首次实现了3,3’-二甲氧基鞣花酸的合成,展示出了POD在合成EA类化合物中极大的应用潜力,同时为其他结构复杂的天然产物的合成提供新的方向。
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