论文部分内容阅读
氮是植物生长发育必所需的矿质营养元素中需求量最大的一种,是氨基酸、蛋白质、核酸、叶绿素、激素等的组成成分。植物体内氮循环是一个复杂的过程,涉及到许多酶。其中根吸收的NH4+或NO3-还原产生的NH4+首先通过谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS;EC 6.3.1.2）催化产生谷氨酰胺（glutamine,Gln）,此反应需要消耗一分子ATP。GS常与谷氨酸合酶（glutamate synthase,GOGAT;Fd-GOGAT:EC1.4.7.1和NADH-GOGAT:EC 1.4.1.14）协同作用,组成GS/GOGAT循环。在这一循环中GS催化NH4+与谷氨酸（Glutamate,Glu）生成Gln,GOGAT则催化Gln将其酰胺基转移至α—酮戊二酸（α-OG）形成两分子Glu。另外,NH+4+也可通过谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH;1.4.1.2～4）催化直接与α-OG反应产生Glu,这是一可逆反应。GS和GOGAT一起构成的循环是高等植物NH4+同化的主要途径,而GDH功能还不太清楚。从能量消耗来看,提高植物中GDH效率是一条提高氮肥利用效率途径。水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物,也是禾谷类作物功能基因组研究的模式植物。本研究以寻求水稻氮高效利用的可能途径为目标,通过用CaMV35S和Ubiquitin启动子超量表达小球藻（Chlorella sorokiniana）gdh基因,对转基因植株进行了分子生物学研究和表型观察。同时通过超量、抑制以及启动子启动绿色荧光蛋白EGFP基因表达,来研究水稻gdh功能,主要指OsGDH1和OsGDH4基因。另外还通过水稻gdh基因结构及表达谱来研究水稻GDH分子特性,探讨它在植物生长和发育过程中作用的分子机理。主要结果如下:1.在水稻中存在4种GDH基因（OsGDH1～4）。水稻和其它物种GDH可分为两类即Ⅰ及Ⅱ。水稻有一个类似Ⅰ型GDH基因,三个Ⅱ型GDH基因（OsGDH1～3）。Ⅰ型比Ⅱ型GDH亚基因家族扩展速率要慢,其中植物Ⅱ型GDH亚基因家族在进化演变时具有物种偏爱性。2.基因表达分析表明OsGDH1、OsGDH2和OsGDH4在所检测的大部分组织或器官中都表达,而OsGDH3只在谷壳和雄蕊中特异表达。3.在无氮（N-）或无磷（P-）条件下OsGDH基因家族各成员的表达谱变化互不相同,表明其在这些胁迫条件下的功能也可能各不相同。4.层次聚类分析（HCA）表明只有OsGDH2和OsGDH4这两个基因才与GS和GOGAT这些已知氮代谢过程中基因聚集到一起。通过HCA我们还是不能确定GDH在水稻氮代谢中反应方向,不过从HCA分析中我们可看出OsGDH家族各成员功能是非冗余的。5.以载体p1301S为基础,构建了3个超量表达载体,以CaMV35S启动子启动基因OsGDH1、OsGDH4和gdhANC在水稻中进行组成型超量表达。通过Southern和Northern杂交,对转基因植株进行转基因拷贝数和表达量的检测,来获得超量表达的单拷贝转基因植株。超量表达这些基因的转基因植株,与野生型植株相比其生长表型没有明显差异,生物产量也没有显著提高。但是生理生化指标的测定结果表明,转基因植株与野生型植株相比表现为更高的代谢水平,包括:叶片中GDH活性和籽粒中氮含量。将CaMV35S启动子换成Ubiquitin启动子启动gdhANC在水稻中进行组成型超量表达,所获得转基因植株也得到类似结果。6.非生物胁迫试验结果表明,超量表达上述gdh的转基因植株在抽穗期对高浓度NaCl（200 mmol/L）表现为明显的抗性。