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目的:体外分离培养家兔脂肪血管基质部分细胞（Stromal Vascular Fractioncells,SVF cells）,并检测其间充质干细胞表面抗原及多向分化潜能,证实其为脂肪基质干细胞（Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs）;制备猪小肠粘膜下层（Small Intestinal Submucosa,SIS）,验证其组织相容性和细胞相容性;观察ADSCs-SIS复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果;观察经体外成软骨诱导的ADSCs-SIS复合物用于治疗家兔胫骨近端内侧生长板缺损的疗效。方法:第一部分切取家兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,获取脂肪组织中血管基质部分细胞,体外培养扩增,取第3代SVF细胞,流式细胞术检测表面标记物CD29、CD44、CD45,进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,油红O染色鉴定成脂诱导分化,碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Von Kossa染色鉴定成骨诱导分化,Ⅱ型胶原mRNA RT-PCR检测、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色鉴定成软骨诱导分化,MTT法绘制细胞生长曲线;第二部分使用酶消化-高渗盐水脱细胞法制备猪小肠粘膜下层脱细胞基质材料,-52℃深低温冷冻干燥,伽玛射线灭菌分装,取1cm2大小SIS植入家兔肌袋中,于术后2周和4周取材进行HE切片检测。SIS复水后,接种第3代脂肪基质干细胞于SIS的单面或双面,空白SIS支架材料和细胞支架材料复合物进行电镜和石蜡切片检测;第三部分将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的SIS双面,加入成软骨诱导培养基,于体外诱导培养第7天和14天后,使用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,GAPDH作为内参基因,使用2-ΔΔCT法计算CT值的标化值,比较未经诱导的ADSCs-SIS复合物、诱导7天和诱导14天的ADSCs-SIS复合物的Ⅱ型胶原mRNA量的变化,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,甲苯胺蓝染色及番红O染色观察细胞外基质,扫描电镜观察体外成软骨诱导14天后细胞在支架材料上生长状况;第四部分将第3代同种异体脂肪基质干细胞接种于SIS的双面,在体外使用成软骨诱导培养基诱导分化14天后,准备植入家兔生长板缺损。取36只6-8周新西兰大耳白兔,随机分为A、B、C三组,每组12只,三组均造成右侧胫骨近端内侧生长板50%的缺损,A组为空白对照组,缺损不植入填充物,B组缺损填充空白SIS支架材料,C组填充在体外进行成软骨诱导14天的ADSCs-SIS复合物,左侧为正常对照组,不进行手术。于术后4、8、16周,每组各处死4只家兔,取双侧胫、腓骨,10%福尔马林固定,X线片摄片,测量双侧胫骨长度及胫骨上关节面角度,计算每只兔左、右侧胫骨上关节面角度差值及胫骨长度差值,组内比较家兔双侧胫骨长度及胫骨上关节面角度差异,组间比较胫骨长度差值及胫骨上关节面角度差值的差异。石蜡切片观察生长板软骨修复状况。应用SPSS 13.0软件进行数据录入和统计学处理,采用配对T检验和单因素方差分析进行分析。结果:第一部分家兔原代脂肪基质血管部分细胞为短梭形及多角形,5-7天达90%融合,传代后,转变为长梭型,传至第6代,仍保持长梭形,且继续增殖。脂肪基质血管部分细胞成骨诱导后14天,碱性磷酸酶染色阳性,诱导28天后,茜素红染色、Von Kossa染色阳性,成脂诱导后7天,油红O染色阳性。成软骨诱导分化后,Ⅱ型胶原mRNA RT-PCR检测提示SVF细胞在178bp处出现产物条带,SVF细胞诱导3天、7天和14天后,Ⅱ型胶原mRNA RT-PCR产物在178bp处也出现条带,其中诱导7天和14后产物条带信号较强,诱导14天后Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,细胞聚集处甲苯胺蓝异染阳性,番红O染色见胞浆红染。生长曲线提示第三代细胞于接种后第3天达到指数期,第5天达到平台期,成软骨诱导时,脂肪基质干细胞生长变缓。第二部分猪小肠粘膜下层为白色半透明膜状物,冻干后仍为白色膜状物,γ射线辐照消毒后,颜色不发生改变,电镜检测提示SIS粘膜面为光滑面,浆膜面为粗糙面,石蜡切片检测显示SIS纤维表面无细胞残留,经完全培养基复水后,SIS为柔软膜状物,复合ADSCs后,相差显微镜下可见材料表面有细胞附着生长,扫面电镜检测提示单面复合ADSCs后,上表面可见大量ADSCs附着,下表面只有少量ADSCs附着,双面复合ADSCs后,上、下表面均可见大量ADSCs附着,石蜡切片显示ADSCs附着SIS纤维生长,SIS植入家兔肌袋后,无感染及免疫排斥反应发生,石蜡切片显示2周时SIS被完全包裹,4周时,SIS被完全吸收。第三部分Ⅱ型胶原mRNA荧光定量RT-PCR检测提示,体外成软骨诱导后7天、14天的ADSCs—SIS复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的ADSCs—SIS复合物有显著性差异（P＜0.05）,诱导14天与诱导7天的ADSCs—SIS复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值有显著性差异（P＜0.05）,ADSCs—SIS复合物成软骨诱导后14天,Ⅱ型胶原免疫组化染色为阳性,甲苯胺蓝染色可见基质异染,番红O染色可见细胞外基质致密红染,未诱导的ADSCs—SIS复合物Ⅱ型胶原免疫组化染色为阴性。扫描电镜检测显示诱导14天时,细胞长满支架材料的双面。第四部分家兔术后饮食、活动正常,伤口无感染,无免疫排斥反应。标本大体观察提示移植后4周,A组右侧胫骨近端关节面明显成角畸形,B组右侧胫骨近端关节面稍有成角畸形,C组右侧胫骨近端关节面无明显成角畸形,三个组均无明显的胫骨短缩畸形;术后8周,A组右侧胫骨近端关节面有明显成角畸形,胫骨有短缩畸形,B组右侧胫骨近端关节面有成角畸形,胫骨有短缩畸形,C组右侧胫骨近端关节面无成角畸形,胫骨无短缩畸形;术后16周,A组右侧胫骨近端关节面有明显成角畸形,胫骨有明显短缩畸形,B组右侧胫骨近端关节面有明显成角畸形,胫骨有明显短缩畸形,C组右侧胫骨近端关节面无成角畸形,胫骨无短缩畸形。X线片测量的组内比较提示,A组在4、8、16周时,左、右侧胫骨上关节面角度和胫骨长度具有显著性差异（P＜0.05）;B组在4周时,左、右侧胫骨上关节面角度无显著性差异（P＞0.05）,胫骨长度有显著性差异（P＜0.05）,8周时,左、右侧胫骨上关节面角度无显著性差异（P＞0.05）,胫骨长度无显著性差异（P＞0.05）,16周时,左、右侧胫骨上关节面角度有显著性差异（P＜0.05）,胫骨长度有显著性差异（P＜0.05）;C组在4、8、16周时,左、右侧胫骨上关节面角度均无显著性差异（P＞0.05）,胫骨长度均无显著性差异（P＞0.05）。X线片测量的组间比较提示,术后4周时,A组胫骨近端关节面成角差值大于B组（P＜0.05）和C组（P＜0.05）,而B组与C组无显著性差异（P＞0.05）,三个组胫骨长度差值无显著性差异（P＞0.05）;术后8周,A组胫骨近端关节面成角差值大于B组（P＜0.05）和C组（P＜0.05）,而B组与C组无显著性差异（P＞0.05）,A组胫骨长度差值大于B组（P＜0.05）和C组（P＜0.05）,B组与C组无显著性差异（P＞0.05）;16周时,A组胫骨近端关节面成角差值大于B组（P＜0.05）和C组（P＜0.05）,而B组大于C组（P＜0.05）,A组胫骨长度差值大于B组（P＜0.05）和C组（P＜0.05）,而B组大于C组（P＜0.05）。HE染色切片示,在术后4周,A组生长板有骨桥形成,未见修复软骨,B组生长板内可见骨桥形成,有少量的修复软骨出现,C组生长板内无骨桥形成,修复软骨排列呈无序状;术后8周,A组生长板内骨桥未被吸收,生长板软骨中断,B组生长板内骨桥未被吸收,生长板软骨中断,C组生长板软骨排列成柱状;术后16周,A组生长板骨桥未被吸收,外侧生长板未闭合,B组生长板缺损内骨桥致密,生长板软骨中断,外侧生长板未闭合;C组生长板为软骨性修复,软骨呈柱状排列,生长板未闭合。结论:第一部分脂肪血管基质部分细胞的间充质干细胞表面标记物为阳性,具有多向诱导分化潜能,证实所获取的SVF细胞为脂肪基质干细胞。第二部分酶消化—高渗盐水脱细胞法制备的小肠粘膜下层具有良好的组织相容性和细胞相容性,适合作为脂肪基质干细胞的支架材料。第三部分脂肪基质干细胞复合至小肠粘膜下层后,在体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,能够向成软骨细胞分化。第四部分体外成软骨诱导分化后的ADSCs-SIS复合物,用于治疗家兔胫骨近端生长板缺损,有效避免了肢体的成角和短缩畸形,并且能够修复生长板软骨,为ADSCs-SIS复合物体外成软骨诱导分化后用于临床治疗生长板损伤提供一定参考。