背景:急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是常见的急性白血病,致死率高,预后风险大,复发率居高不下。相比于正常造血祖细胞,AML细胞具独特的线粒体特征,高度依赖线粒体氧化磷酸化产生能量。由线粒体DNA（mtDNA）编码的线粒体呼吸链亚基对线粒体氧化磷酸化至关重要。干扰这些亚基的合成,诱导线粒体功能障碍,进而导致AML细胞凋亡,有希望成为治疗AML的一种有效途径。NR4A孤核受体亚家族基因是进化保守的立早基因,Nur77与Nor1是NR4A1与NR4A3分别编码的蛋白。研究发现在血液恶性肿瘤中Nur77和Nor1具有重要的抗肿瘤活性,同时Nur77和Nor1表达缺失是AML患者的共同特征。针对性恢复Nur77和Nor1的表达是治疗AML的新型潜在途径。藁本内酯（Z-ligusilide,Z-LIG）是经典活血化瘀中药川芎的主要活性成分,具有多种药理活性。实验室前期研究表明藁本内酯可激活AML细胞线粒体Nur77/Nor1-Bc12凋亡机制。在一些疾病模型上,有报道Nur77/Nor1与线粒体功能也存在密切关联,Nur77与Nor1的过表达与线粒体定位可诱导ATP生成速率降低,进而导致线粒体功能障碍。在AML细胞上,Nur77/Nor1与藁本内酯对线粒体呼吸链功能及ATP合成的影响还有待研究。本研究由国家自然科学基金项目（项目编号:81973530、82003980）资助。目的:研究Nur77/Nor1对急性髓系白血病细胞线粒体功能的影响与下游机制,并明确藁本内酯是否可通过Nur77/Nor1介导的通路来影响急性髓系白血病细胞线粒体功能。方法:（1）藁本内酯选择性抑制急性髓系白血病细胞潜在靶标分析SRB法检测藁本内酯对三种AML细胞和两种正常细胞存活率的影响。然后,以HL-60细胞和HEK293T细胞为研究对象,流式细胞术检测藁本内酯对细胞凋亡的影响。将藁本内酯处理后的HL-60细胞进行转录组测序,对结果中的差异表达基因（DEGs）进行分析。（2）Nur77/Nor1、藁本内酯对AML细胞线粒体功能的影响以HL-60细胞和HEK293T细胞为研究对象,考察过表达Nur77与Nor1（转染 ov-Nur77、ov-Nor1、ov-Mix（Nur77+Nor1）及空载体 Vector）、单独给予藁本内酯以及抑制 Nur77 与 Nor1（转染 NC、siNur77、siNor1、siMix（Nur77+Nor1））后给予藁本内酯对细胞线粒体功能的影响。采用JC-1法检测细胞线粒体膜电位,荧光素酶法检测细胞线粒体ATP水平,流式细胞术检测细胞线粒体活性氧含量。（3）Nur77/Nor1、藁本内酯对AML细胞线粒体DNA的影响将HL-60细胞长时间暴露于低浓度溴化乙锭环境中,构建线粒体DNA缺失HL-60 ρ0细胞株（缺少线粒体呼吸链）,PCR验证细胞株是否构建成功。以HL-60细胞和HL-60 ρ0细胞为研究对象,流式细胞术检测过表达Nur77/Nor1、藁本内酯在两种细胞上的凋亡诱导水平。此外,检测尿苷、丙酮酸钠对Nur77/Nor1或藁本内酯诱导的HL-60细胞凋亡的影响。qPCR检测Nur77/Nor1、藁本内酯对HL-60细胞MYC,线粒体DNA编码转录的基因ND1、ND2、ND6、Cytb、CoxⅠ、CoxⅡ,核DNA编码转录的基因SYMD2,线粒体转录相关因子TUFM、TFAM、TSFM、TFB2M,线粒体翻译相关因子MRPL4、MRL12 mRNA水平的影响。Western blotting法检测MYC,线粒体DNA编码的Cox Ⅰ、Cox Ⅱ以及核基因编码的Cox Ⅳ表达水平。（4）藁本内酯对AML细胞线粒体动态平衡的影响SRB法检测线粒体分裂抑制剂Mdivi-1或促进剂FCCP对藁本内酯抑制AML细胞作用的影响。流式细胞术检测Mdivi-1对藁本内酯诱导HL-60细胞凋亡的影响。Western blotting法检测藁本内酯对线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1,线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1、Mff、p-Drp1表达的影响。（5）藁本内酯对AML患者骨髓单核细胞的影响使用Ficoll-Paque PLUS试剂分离得到AML患者骨髓单核细胞,SRB法检测藁本内酯对细胞有无抑制作用,流式细胞术检测藁本内酯对细胞凋亡的影响,荧光素酶法检测藁本内酯对细胞线粒体ATP生成量的作用。结果:（1）线粒体转录翻译可能是藁本内酯抑制AML细胞的潜在靶标SRB法结果显示藁本内酯浓度依赖性的抑制AML细胞（HL-60,Kasumi-1和MV-4-11）,而对正常细胞（293T和HUVEC）显示出较弱的活性（IC50＞50 IμM）。流式细胞术结果表明,藁本内酯选择性诱导HL-60细胞凋亡,且呈浓度依赖性。对藁本内酯处理后的HL-60细胞进行转录组测序,结果显示藁本内酯调控的1766个差异表达基因中98个基因（5.55%）与线粒体DNA复制、转录、翻译相关,且几乎均为抑制作用。差异表达基因的GO分类与富集分析表明DEG主要分布在细胞翻译等生物学过程。同时,KEGG富集分析表明DEG主要属于泛醌和其他萜类醌的生物合成,果糖和甘露糖的代谢,碳水化合物的消化吸收等途径,这些途径均与能量代谢相关。表明线粒体转录翻译可能是藁本内酯抑制AML细胞的潜在靶标。（2）藁本内酯通过上调Nur77与Nor1诱导AML细胞线粒体功能障碍对线粒体ATP含量的测定结果显示ov-Nur77、ov-Nor1和ov-Mix降低HL-60细胞线粒体ATP生成量（P＜0.05）,升高293T细胞线粒体ATP生成量（P＜0.01）。同时,藁本内酯（5-100 μM）可浓度依赖性降低HL-60细胞线粒体ATP生成量（P＜0.01）,而藁本内酯（10-50 μM）可升高293T细胞线粒体ATP含量（P＜0.05）。Western blotting检测表明藁本内酯可恢复HL-60细胞Nur77与Nor1的表达。siNur77、siNor1和siMix可部分逆转藁本内酯引起的HL-60细胞线粒体ATP生成量降低（P＜0.01）。JC-1检测结果表明,ov-Nur77、ov-Nor1和ov-Mix降低HL-60细胞线粒体膜电位（P＜0.05）。ov-Nur77和ov-Nor1对293T细胞的线粒体膜电位无显著影响,而ov-Mix可使其升高（P＜0.001）。藁本内酯可选择性降低HL-60细胞线粒体膜电位。siNur77、siNor1和siMix可部分逆转藁本内酯引起的HL-60细胞线粒体膜电位下降,其中siNor1和siMix效果显著（P＜0.01）。流式细胞术结果显示,ov-Nur77、ov-Nor1和ov-Mix可升高HL-60细胞线粒体活性氧水平。与HL-60细胞相比,过表达Nur77与Nor1对293T细胞线粒体活性氧的影响较弱。藁本内酯10 μM即可引起HL-60细胞线粒体活性氧显著升高,而在293T细胞上,藁本内酯50 μM时线粒体活性氧才表现出升高的效果。siNur77、siNor1和siMix可部分逆转藁本内酯引起的HL-60细胞线粒体活性氧升高。（3）Nur77/Nor1与藁本内酯影响线粒体DNAPCR结果显示线粒体DNA缺失的HL-60 ρ0细胞株（缺少线粒体呼吸链）构建成功。流式细胞术结果显示,与HL-60细胞相比,过表达Nur77/Nor1、藁本内酯对HL-60 ρ0细胞的凋亡诱导活性显著降低（P＜0.01）。并且,尿苷和丙酮酸钠可部分逆转过表达Nur77/Nor1、藁本内酯对HL-60细胞的凋亡诱导作用（P＜0.001）。表明Nur77/Nor1、藁本内酯诱导的AML细胞凋亡是通过线粒体呼吸链发挥作用的。RT-qPCR结果显示藁本内酯以及过表达Nur77与Nor1下调了MYC,线粒体DNA编码转录的基因ND1、ND2、ND6、Cytb、Cox Ⅱ,线粒体转录相关因子TUFM、TFAM、TSFM、TFB2M,线粒体翻译相关因子MRPL4、MRL12的表达,而对Cox Ⅰ,以及核DNA编码转录的基因SYMD2无显著影响。Western blotting法结果显示藁本内酯以及过表达Nur77与Nor1下调线粒体DNA编码的Cox Ⅱ的表达,下调MYC的表达,而对Cox Ⅰ、核基因编码的Cox Ⅳ表达无显著影响。（4）藁本内酯影响AML细胞线粒体动态平衡线粒体分裂抑制剂Mdivi-1预处理明显减弱藁本内酯对HL-60细胞的抑制作用,降低了凋亡水平。进一步的Western blotting结果显示,藁本内酯下调线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1的表达,上调分裂蛋白Fis1、Mff的表达,促进Drp1磷酸化与线粒体转位。表明藁本内酯促进AML细胞线粒体分裂,影响细胞线粒体动态平衡。（5）藁本内酯对AML患者骨髓单核细胞有抑制作用SRB实验结果显示藁本内酯抑制AML患者骨髓单核细胞,流式细胞术结果显示藁本内酯诱导AML患者骨髓单核细胞凋亡。荧光素酶法测定细胞线粒体ATP,结果表明藁本内酯显著抑制AML细胞线粒体ATP的生成（P＜0.001）。结论:藁本内酯可选择性抑制AML细胞并诱导AML细胞凋亡。引起线粒体功能障碍可能是Nur77与Nor1抑制AML的下游机制。藁本内酯可通过Nur77与Nor1引起AML细胞线粒体功能障碍,这一过程可能与干扰线粒体DNA的转录相关。此外,藁本内酯还影响AML细胞线粒体动态平衡,诱导线粒体分裂。最后,藁本内酯对AML患者骨髓单核细胞有抑制作用。