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带有羰基、硝基、亚胺基等吸电子基团的饱和羰基化合物是合成医药、香料和食品添加剂的前体。通过化学催化剂还原α,β-不饱和化合物的碳碳双键可以获得饱和羰基化合物。相对化学催化,烯酮还原酶催化还原α,β-不饱和羰基化合物的碳碳双键,具有反应条件温和、化学选择性好、立体选择性高、副产物少和环境友好等诸多内在优点,因此成为获得带吸电子基团饱和羰基化合物的方法之一。本论文基于对两种新型烯酮还原酶的挖掘、酶学性质和催化功能研究,建立了高效还原(R)-香芹酮和茶香酮的酶催化反应体系,进而建立起由烯酮还原酶和酮还原酶双酶催化茶香酮合成羟基酮的反应体系。 首先,根据生物信息学分析分别从Meyerozyma guilliermondii ATCC6260和Ogataeaangusta NCYC495中获得烯酮还原酶基因mger和oaer,并成功在E.coli BL21(DE3)中获得可溶表达。酶学性质研究表明,MgER和OaER都属于FMN结合的烯酮还原酶,其中MgER天然状态下为单聚体,而OaER天然状态下为二聚体。MgER最适温度为30℃,最适pH为7.0; OaER最适温度为40℃,最适pH为7.5。MgER和OaER对于带有两个羰基的不饱和化合物(如:茶香酮、对苯醌、马来酰亚胺等)均展现出较高的催化活力。MgER对(R)-香芹酮和茶香酮表现严格的立体选择性,还原产物分别为(2R,5R)-二氢香芹酮(de>99%)和(R)-levodione(ee>99%)。 其次,建立了MgER催化(R)-香芹酮和茶香酮的酶促反应体系,在最适反应条件下,可完全转化200mM的(R)-香芹酮产物,(2R,5R)-二氢香芹酮的得率为97.4%,de>99%,时空产率为12.18 mM/h;同样反应条件下,可完全转化500mM的茶香酮生成(R)-levodione,产物得率为96.7%,ee>99%,时空产率为40.29 mM/h。 第三,OaER对茶香酮展示出高的活力(5.07 U/mg)和立体选择性(ee>99%),在最适反应条件下,6h内OaER可以催化1M茶香酮转化成(R)-levodione,产物得率为96.8%,ee>99%,时空产率为161.3 mM/h。筛选得到可选择性还原(R)-levodione的酮还原酶KR85,利用OaER和KR85的双酶级联反应,转化茶香酮生成4-羟基-3,3,5-三甲基环己酮。