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能量代谢障碍综合征(如肥胖症和II型糖尿病)是严重威胁人类健康的疾患,得到世界范围内越来越多的密切关注。研究发现,下丘脑中过量的Foxo1能抑制瘦素的信号通路,诱导动物产生瘦素抵抗,从而导致能量代谢障碍,但其作用发生机制仍然不明。实验室前期在培养的细胞实验中发现,一种缺乏DNA结合域的突变型Foxo1(Foxo1ΔDBD)可以促进瘦素的信号传导,提示此突变体有可能对动物的整体能量代谢有促进作用,从而用于防止能量代谢障碍的发生。为此制备了Foxo1ΔDBD的转基因动物。本论文以该转基因动物为主要实验对象,研究了Foxo1ΔDBD对动物整体能量代谢的调节作用,并且结合细胞生物学的实验,对其可能的作用机制进行了探讨。1.小鼠的扩群。实验室前期制备出了10个Foxo1ΔDBD转基因首建鼠,并分别繁殖成系。在此基础上,本实验进行了转基因小鼠Line7的扩群。让杂合和野生基因型小鼠进行交配,从子代小鼠中鉴定出杂合型和野生型。繁育并鉴定了F4-F9代共6代小鼠,基因型鉴定采用PCR的方法,结果显示方法准确可靠,并说明转基因得到了稳定的遗传。2.体重和采食量的测定。选取F7代3周龄Foxo1ΔDBD转基因雄性小鼠和野生型小鼠各16只,每三天检测小鼠体重和采食量,持续72天。实验结果显示,标准饲料(Chow diet)饲喂条件下,F7代Foxo1ΔDBD转基因小鼠体重与野生型小鼠差异不显著。高脂饮食(High fat diet)下的F7代Foxo1ΔDBD转基因小鼠体重与野生型小鼠差异不显著。在F4代65周龄时再次检测体重和采食量,持续66天,Foxo1ΔDBD转基因小鼠的体重显著小于野生型小鼠(P<0.05),而采食量在这一期间与野生型小鼠没有显著差异(P>0.05)。3.代谢笼实验。选取F4代73周龄的Foxo1ΔDBD转基因小鼠和野生型雄性小鼠各8只,进行代谢笼实验。结果显示,Foxo1ΔDBD转基因小鼠的耗氧量(P<0.001)、CO2的产生量(P<0.01)以及产热量(P<0.01)都显著高于野生型小鼠。4.,通过转录组测序法筛选其BAT中的差异表达基因。通过分析发现Foxo1ΔDBD转基因小鼠和野生型小鼠BAT中存在206个差异表达基因(P<0.05,|Log2 Fold Change|>1),并选取8周龄雄性小转录组测序和Real Time PCR法验证。对Foxo1ΔDBD转基因小鼠内差异表达基因进行筛选,并进行QPCR验证。选择F7代6只8周龄雄性小鼠(Foxo1ΔDBD转基因小鼠和野生型小鼠各3只),分离出棕色脂肪组织(BAT)鼠(Foxo1ΔDBD转基因小鼠和野生型小鼠各8只)对解偶联蛋白1(UCP1)、碘甲腺原氨酸脱碘酶2(Dio2)等9个基因的转录进行QPCR验证,验证结果与转录组测序结果一致。5.UCP1启动子活性实验。为了验证Foxo1ΔDBD转基因对动物UCP1基因表达的促进作用,构建UCP1启动子质粒p GL3-UCP1,在3T3 L1细胞系中共转染p GL3-UCP1、p CMV-myc-Foxo1ΔDBD或p CMV-myc-Foxo1,发现Foxo1可以显著抑制UCP1启动子的活性(P<0.05),而Foxo1ΔDBD所占比例超过75%可消除这种抑制作用。6.Foxo1与UCP1启动子结合实验。为了了解转基因小鼠BAT中UCP1的表达升高的机制,采用染色质免疫沉淀(Ch IP)方法检测小鼠BAT中Foxo1与UCP1启动子结合情况。结果显示,在野生型小鼠中可以检测到Foxo1与UCP1启动子的结合,而在Foxo1ΔDBD转基因小鼠中几乎检测不到这种结合,说明Foxo1ΔDBD竞争性地抑制了Foxo1与UCP1启动子的结合,从而解除了Foxo1对UCP1启动子的抑制作用。7.血浆T3和T4水平的测定。由于Foxo1ΔDBD转基因小鼠BAT中的Dio2基因的表达显著升高,推测其表达产物会促进T4脱碘生成T3的过程,所以对16只8周龄雄性小鼠(Foxo1ΔDBD转基因小鼠和野生型小鼠各8只)血浆中总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总四碘甲状腺原氨酸(TT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和游离四碘甲状腺原氨酸(FT3)进行了测定,结果显示,Foxo1ΔDBD转基因小鼠的TT3和FT3水平均显著高于野生型小鼠(P<0.05),符合预期。8.侧脑室注射S3I-201实验。Foxo1ΔDBD在上调能量代谢时伴随STAT3磷酸化水平降低,S3I-201是一种STAT3磷酸化抑制剂,我们可以通过脑室注射S3I-201来模拟Foxo1ΔDBD的作用。因此选取接近的8周龄雄性KM鼠,分为四组,在其侧脑室分别或同时注射瘦素和STAT3磷酸化抑制剂S3I-201(n=10),结果显示注射S3I-201的小鼠采食量未出现显著下降而体重显著下降(P<0.05)。结论:Foxo1ΔDBD能够影响动物能量代谢,使小鼠的代谢水平升高,初步机制为Foxo1ΔDBD消除Foxo1对UCP1启动子负调控作用来上调BAT中UCP1基因的表达、Dio2表达上调引起T3升高从而促进UCP1表达。同时对Foxo1ΔDBD在瘦素信号通路中对STAT3磷酸化水平调控的模拟,探讨了小鼠的能量代谢水平在此影响下的变化。实验发现Foxo1ΔDBD对动物能量代谢的影响并对其机制进行初步研究,为治疗肥胖症、糖尿病等能量代谢疾病提供理论依据。