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目的:随着社会的发展,各种创伤发生越来越多,伴随的神经系统损伤的数量也迅速的增加。但由于神经系统修复的复杂性和特殊,神经系统损伤的修复至今仍是一个非常棘手的难题。随着分子生物学的发展,对于神经系统损伤的修复采用基因治疗的方法,将外源性的神经营养因子的基因通过载体定向的导入神经断端,利用受体细胞长期的高效的分泌神经营养因子,促进神经再生轴突的生长,从而促进神经损伤的修复,以期获得良好的效果。虽然利用转基因技术为神经的损伤修复提供了一个非常好的方向,但由于受体对外源性基因及载体的免疫排斥作用,使得外源性基因的长期高效的表达不能实现,这也就限制了神经修复的效果。针对这一瓶颈,本实验采用导入带有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 immunoglobulin, CTLA4Ig)基因腺病毒AdV(Ad CTLA4Ig)和携带LacZ基因的AdV(AdLacZ)微量注射器共同导入大鼠脊髓腰膨大处作为实验组,将未携带外源性基因的Ad0和携带LacZ基因的AdV(AdLacZ)通过微量注射器共同导入大鼠脊髓腰膨大处作为对照组,两组通过比较β-gal在脊髓表达的变化,并通过多聚酶链反应(PCR)监测腺病毒注入后在脊髓量的变化及消失时间和用逆转录多聚酶链反应(PT-PCR)法检测CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表达,以探讨CTLA4Ig诱导机体对AdLacZ的局部免疫耐受的作用及其机理。方法:选用7周龄健康雌性Wister大鼠54只,体重200～250g。将大鼠随机分成四组,A,B每组21只,C,D组每组6只。在往大鼠脊髓注射病毒之前7天,在胸背侧皮下注射AdLacZ 1μl进行预处理。对照组(A组、C组)导入AdlacZ+Ad0,实验组(B组、D组)导入AdlacZ+AdCTLA4Ig。将大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约3cm后正中切口,去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉右侧1mm处注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(A组、C组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B组、D组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗切口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭切口。逐层关闭切口,结束手术。自然条件下恢复清醒,相同条件下喂养进行观察。C组和D组于距第一次手术30天后于脊髓后正中动脉左侧1mm处注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(C组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(D组)。其余手术方法相同。实验组和对照组在转染腺病毒后的9时间点取大鼠脊髓注射点远近端5mm的腰膨大节段,注射点头侧5mm的脊髓节段进行厚50μm的连续冰冻横切片,对实验组和对照组中X-gal染色阳性的切片进行计数,并通过多聚酶链反应(PCR)监测腺病毒注入后在脊髓量的变化及消失时间,用逆转录多聚酶链反应(PT-PCR)法检测CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表达情况。结果:1 X-gal, CTLA4Ig转基因表达:LacZ基因和CTLA4Ig基因转染脊髓双侧的前角运动细胞和周围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各0.5cm区段,表达高峰时有转基因表达的阳性冰冻横切片数≤120片。切片观察可见实验对照组的X-gal染色阳性表达时间约为15天;而实验组的X-gal染色阳性表达时间约为60天。实验组脊髓阳性切片计数显示β-gal在脊髓腰膨大表达的高峰期均在4天和9天,15天后β-gal在脊髓腰膨大X-gal染色阳性表达量逐步减少,在60天仍能见到低表达量。统计学分析表明两组之间在高峰期间阳性切片数有显著差异(P<0.05)。并且AdLacZ基因在脊髓表达的时间明显延长。2腺病毒液PCR检测:腺病毒的表达量随着浓度的降低而逐渐减小。采用病毒液10倍系列稀释提取后DNA经PCR反应可检测出腺病毒的特异性条带的最低稀释度为104。AdlacZ(1×109pfu/ml)与Ad0(5×109 pfu/ml)特异性条带的最低稀释度一致。3脊髓标本腺病毒PCR检测:用PCR法从DNA水平分别检测腺病毒在实验对照组、实验组的表达情况,腺病毒的DNA量是随时间延长逐渐下降的,实验对照组至39天检测不到腺病毒的表达,实验组60天时仍能检测到腺病毒的表达。4 RT-PCR实验的结果4.1β-gal RNA在大鼠脊髓腰膨大处局部表达用RT-PCR法从mRNA水平分别检测β-gal在实验对照组、实验组的表达情况:转染2天后两组均可检测出β-gal mRNA在大鼠脊髓腰膨大组织的表达,对照组在30天处未检测β-gal的目标条带,实验组在60天处仍可见到β-gal表达的目标条带,但亮度以明显变暗,可见在初次导入腺病毒及第二次导入腺病毒30天β-gal mRNA仍有低量的表达。4.2 CTLA4Ig mRNA在大鼠脊髓腰膨大组织局部的表达,用RT-PCR法从mRNA水平分别检测CTLA4Ig mRNA在实验组的表达情况。转染2天后实验组可检测出CTLA4Ig mRNA在大鼠脊髓腰膨大组织的表达,在初次导入腺病毒的60天和第二次导入腺病毒的30天处可见到CTLA4Ig mRNA的目标条带,可见最亮处为初次导入的4天和9天处,第二次导入腺病毒的第9天和初次导入腺病毒的第9天出相比较暗。结论:在预先致敏的大鼠体内,将AdV介导的CTLA4Ig基因注射入脊髓腰膨大处能有效地抑制局部T淋巴细胞的浸润,从而减轻由AdV介导的局部炎症反应,抑制机体对病毒载体的排斥反应,显著延长LacZ基因在脊髓的表达时间,并且能明显增强与其共同导入的LacZ基因表达强度。而且AdCTLA4Ig对体液免疫应答有明显的抑制作用,能明显延长腺病毒在体内的存留时间。