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野外采集印度块菌(Tuber indicum Cooke&Massee)子囊果以及在云南松(Pinusyunnanensis Franch.)上形成的菌根根际土壤,用传统平板培养的方法分离获得他们的可培养细菌和真菌类群。用Roche454高通量测序技术对块菌子囊果内和菌根际土壤中细菌16S-rDNA的V1-V3区测序,然后进行鉴定和分类学分析,揭示印度块菌菌根根际微生物的多样性和优势类群。对84份白块菌标本进行了研究,结合经典分类学、电子扫描技术以及分子系统学的研究手段,发现了12个白块菌的新种,并对其中11个新种做了详细的形态学描述和绘图。主要研究结果如下:
1、块菌菌根际和子囊果内可培养微生物多样性研究总计分离得到根际可培养细菌793株,分别隶属于于丙型变形菌门(γ-proteobacteria)的Pseudomonas属,乙型变形菌门(β-proteobacteria)的Acinetobacter属,放线菌门(Actinobacteria)的Streptomyces属,其中假单胞菌Pseudomonas是印度块菌×云南松菌根际可培养细菌的优势类群。分离得到根际可培养真菌338株,分别隶属于发菌科(Trichocomaceae)的青霉菌属(Penicillium)、和曲霉菌属(Aspergillus),肉座菌科(Hypocreaceae)的肉座菌属(Hypocrea),丛赤壳科(Nectriaceae)的丛赤壳菌属(Nectria)和赤壳菌属,生赤壳菌科(Bionectriaceae)的生赤壳菌属(Bionectria)和镰刀菌属(Fusarium),亚赤壳科(Hyponectriaceae)的Microdochium属,Herpotrichiellaceae科的外瓶霉属(Exophiala),其中发菌科里的青霉属和曲霉属是印度块菌×云南松菌根际可培养真菌的优势类群。
总计分离得到印度块菌子囊果内可培养细菌331株64个OTUs,分别隶属于丙型变形菌门Pseudomonas属、Acinetobacter属、贪噬菌属(Variovorax)和Streptomyces属,其中假单胞菌Pseudomonas是印度块菌子囊果内细菌的优势类群。未分离到印度块菌子囊果内可培养真菌。
2、块菌菌根际和子囊果内细菌总DNA分析总计得到块菌根际细菌16s-rDNA可变区序列8937条2073个OTUs。根际细菌的2073个OTUs分属于细菌的20个门198属,其中隶属于变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)三门的OTUs占总OTUs的66%,是其优势门类;隶属于黄杆菌属(Flavobacterium根瘤菌属(Rhizobium)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomona)、贪噬菌属(Variovorax)、Sphingopyxis属、新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、Phenylobacterium属、Pedobacter属8属的OTUs占总OTUs的57%,是其优势属。
8937株细菌在不同门的分布数量:变形菌门细菌的数量占52.45%,拟杆菌门细菌的数量占16.32%,放线菌门细菌的数量占15.79%,浮霉菌门细菌的数量占4.04%,酸杆菌门细菌的数量占3.11%,其余16门的细菌数量占8.29%,在细菌数量的分布上,变形菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌是其优势类群;在不同属的分布数量:黄杆菌属细菌的数量占19.61%,根瘤菌属细菌的数量占7.71%,假黄色单胞菌属细菌的数量占5.73%,贪噬菌属细菌的数量占4.96%,Sphingopyxis属细菌的数量占3.18%,新鞘氨醇菌属细菌的数量占2.69%,Phenylobacterium属细菌的数量占2.17%,Pedobacter属细菌的数量占2%,其余190属细菌的数量占51.95%,在细菌数量的分布上,黄杆菌属、根瘤菌属和假黄色单胞菌属是其优势属。
总计得到子囊果内细菌16s-rDNA可变区序列9862条220个OTUs。子囊果内细菌的220个OTUs分属于7门43属,其中隶属于变形菌门、拟杆菌门、放线菌门的OTUs占总OTUs的94%,是其优势门类;隶属于黄杆菌属、壤霉菌属、微杆菌属、剑菌属、寡养食单胞菌、假单胞菌、Sphingopyxis、贪噬菌属的OTUs占总OTUs的93%,是其优势属。9862株细菌在不同门的分布数量:变形菌门细菌的数量占38.92%,拟杆菌门细菌的数量占32.62%,放线菌门细菌的数量占28.2%,其他4门细菌的数量占0.25%,在细菌数量的分布上,变形菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌数量占绝对优势;在不同属的分布数量:黄杆菌属细菌的数量占31.39%,壤霉菌属细菌的数量占14.38%,微杆菌属细菌的数量占14.02%,剑菌属细菌的数量占13.8%,寡养食单胞菌细菌的数量占12.73%,Sphingopyxis细菌的数量占6.22%,假单胞菌细菌的数量占2.24%,贪噬菌属细菌的数量占2.18%,其他属细菌的数量占3.04%,黄杆菌属、壤霉菌属和微杆菌属细菌在数量上是其优势属。
3、块菌菌根促栖菌研究设置5个菌根组合菌为供试菌根组合:T.indicum×C.mollissima,T.indicum× Q.franchetii, T.aestivum× C.mollissima, T.aestivum× Q.franchetii和T.melanosporum×C.mollissima。选择6株细菌作为供试细菌:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、溶杆菌(Lysobacter capsici)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、瓜两面神菌(Janibacter melonis)、氧化烃微杆菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)和球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)。在块菌接种的过程中在菌剂中分别加入供试细菌和抗生素,幼苗形成菌根后,对菌根苗的菌根进行计数,并测量株高和地径,研究结论如下:
i细菌对于不同的菌根组合形成的菌根数量具有真菌特异性,它会促进某些菌根组合的形成,但却会抑制另外一些真菌形成菌根。块菌子囊果内土著细菌对于菌根的形成有显著促进作用。
ii细菌对于不同组合的菌根苗株高也具有真菌特异性,它会促进某些组合的菌根苗株高,但却会抑制另外一些组合的菌根苗株高。块菌子囊果内土著细菌对于不同组合菌根苗株高的影响不一致。
iii细菌对于不同组合的菌根苗地径也具有真菌特异性,它会促进某些组合的菌根苗地径,但却会抑制另外一些组合的菌根苗地径。块菌子囊果内土著细菌对于不同组合菌根苗地径的影响不一致。
4、白块菌新分类群研究基于ITS序列构建的分子系统树表明,12个白块菌新分类群都形成的独立的分支,能很好的从其近缘种中分出,支持将他们作为新种的处理。本文详细描述了其中11个白块菌新种的形态学特征,并讨论了他们与近缘种的形态差异。