【摘 要】
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细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）是由细胞向外释放的纳米级脂质双层囊泡,广泛存在于细胞外生物液体中,通过携带包括核酸、蛋白质在内的多种生物活性物质参与细胞间信息交流和机体生理功能的调控。在哺乳动物的卵巢卵泡发育中,只有不到1%的卵泡能发育成熟达到排卵期,而其余的卵泡在发育的不同阶段都出现闭锁。颗粒细胞的凋亡是哺乳动物卵泡闭锁的关键因素,目前已有的研究发现卵泡液中EV
【基金项目】
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国家自然基金面上项目（32172936）；
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细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）是由细胞向外释放的纳米级脂质双层囊泡,广泛存在于细胞外生物液体中,通过携带包括核酸、蛋白质在内的多种生物活性物质参与细胞间信息交流和机体生理功能的调控。在哺乳动物的卵巢卵泡发育中,只有不到1%的卵泡能发育成熟达到排卵期,而其余的卵泡在发育的不同阶段都出现闭锁。颗粒细胞的凋亡是哺乳动物卵泡闭锁的关键因素,目前已有的研究发现卵泡液中EVs在卵泡颗粒细胞的增殖、代谢、凋亡等过程中发挥了重要的调控作用,这些EVs可以通过携带生物活性物质执行其细胞间信息交流的功能。但EVs是一类高度异质性的群体,目前关于EVs亚型功能的研究较少。本研究通过探究EVs亚型之一LD-sEVs对颗粒细胞凋亡的影响,并挖掘其中的关键成分及相关机制,为进一步揭示LD-sEVs对卵泡发育和卵泡闭锁的调控作用提供理论依据。本研究通过差速超速离心和碘克沙醇密度梯度离心的方法成功从牛小卵泡的卵泡液中分离出了sEVs的亚型LD-sEVs,并对其进行了鉴定,用LD-sEVs处理卵泡颗粒细胞,采用流式细胞术、RT-q PCR、WB等方法,检测LD-sEVs对卵泡颗粒细胞凋亡的影响,筛选出了LD-sEVs中高表达的mi RNA成分——let-7i,并进行了let-7i在颗粒细胞中的靶向验证。获得的研究结果如下:（1）利用透射电镜、纳米粒径分析和WB技术对分离的LD-sEVs进行鉴定,结果显示,分离的LD-sEVs呈现茶托状,98.98%的囊泡大小在30-150 nm之间,主要集中在69.25 nm处,sEVs标志蛋白CD63和TSG101阳性,而l EVs标志蛋白GP96阴性,说明分离得到的LD-sEVs纯度较高,无l EVs污染;利用FSHR染色的方法对分离得到的颗粒细胞进行鉴定,结果显示97.53%的细胞为颗粒细胞,分离得到的颗粒细胞纯度较高。（2）用PKH67标记LD-sEVs与颗粒细胞共培养,发现颗粒细胞可以摄取LD-sEVs。LD-sEVs处理后颗粒细胞的凋亡率显著下降,主要表现为颗粒细胞早期凋亡率显著下降;颗粒细胞中Bcl2基因表达量上调,Caspase3、Caspase8、CHOP基因表达量下调;Bcl2蛋白表达量增加,Bax和FADD蛋白表达量减少,Bcl2/Bax比值升高,颗粒细胞Caspase3酶活性降低。（3）LD-sEVs处理后颗粒细胞let-7i表达量显著升高,转染let-7i mimic至颗粒细胞,颗粒细胞的凋亡率显著下降,主要是早期凋亡率显著下降;颗粒细胞中Caspase3基因表达量显著下调,并且Bax和FADD蛋白表达显著减少,Bcl2/Bax比值升高,颗粒细胞Caspase3酶活性显著下调。（4）根据生信分析结果选定FasL作为let-7i的候选靶基因进行后续研究。构建了野生型和突变型FasL的PsiCHECKTM-2报告载体,双荧光素酶报告基因结果显示,用WT-Fas L-Psi CHECKTM-2报告载体和let-7i mimic共转的293T细胞RLU1/RLU2的比值显著低于对照组,该结果同时在牛卵泡颗粒细胞上得到了验证。转染let-7i mimic后颗粒细胞中Fas L的蛋白水平显著下降;利用si RNA技术干扰颗粒细胞Fas L的表达,结果发现可以显著抑制颗粒细胞凋亡,表现为颗粒细胞早期凋亡率显著降低;颗粒细胞中Bax和FADD蛋白表达量显著下降,Bcl2/Bax比值增大,Caspase3酶活性显著下调,表明let-7i对Fas L可以进行靶向性调控。用LD-sEVs处理颗粒细胞可显著下调Fas L蛋白的表达;let-7i inhibitor转染LD-sEVs处理过的颗粒细胞的Fas L蛋白表达量显著高于LD-sEVs处理组,表明let-7i在LD-sEVs抑制颗粒细胞凋亡的过程中发挥了关键性作用。综上所述,牛小卵泡卵泡液LD-sEVs及其携带的let-7i通过靶向Fas L抑制颗粒细胞的凋亡,在调控卵泡正常发育方面发挥重要作用。
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