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研究背景驱动结合蛋白(Kinectin1,KTN1)是微管驱动蛋白的一类配体蛋白亚型,其定位于内质网膜上,为内质网的组成蛋白之一。相关研究在人肝细胞肿瘤中发现了 KTN1的多种变体和剪切体,提示了 KTN1与肿瘤的相关性。本课题组前期发现长链非编码RNA介导的MALAT1-KTN1-EGFR调控轴促进上皮鳞状细胞癌的发展同时明确了 KTN1对EGFR翻译的调控。EGFR是表皮生长因子受体家族的重要成员之一,分布于人体各类细胞膜系统中。EGFR的异常表达对其下游信号转导发挥重要调控作用并与多种肿瘤的发生、发展以及预后过程息息相关。研究表明EGFR广泛参与调控上皮鳞状细胞癌众多生物学过程,而关于KTN1在上皮鳞状细胞癌的功能却未见报道。本课题组的发现证明了 KTN1与EGFR信号通路转导的关系以及其在上皮鳞状细胞癌中的作用,但是关于KTN1如何调控EGFR的翻译过程这一科学问题尚未阐明。因此,探究上皮鳞状细胞癌中KTN1调控EGFR的具体机制显得尤为重要。本研究以前期实验中敲减KTN1减少EGFR蛋白表达这一生物学现象为科学问题,明确现象的产生是由蛋白质合成还是降解途径来介导。此外通过定量蛋白组学技术筛选差异性的调节蛋白,同时利用细胞生化实验技术验证靶蛋白在具体通路中的功能从而更为深入地探究KTN1对EGFR翻译的调控的具体机制,最后以裸鼠移植瘤模型在整体水平上验证调控机制中的关键蛋白。方法①分别在皮肤鳞癌细胞系HSC-1和HSC-5以及对照细胞系HaCaT中用siRNA敲减KTN1后,通过qPCR和Western blot检测EGFR的mRNA和蛋白水平的表达;敲减EGFR后,通过Western blot检测KTN1蛋白水平的表达;敲减KTN1后,检测细胞凋亡百分比和存活分数。②通过CHX和MG-132分别干预A431和HSC-5细胞,用Western blot检测敲减KTN1后EGFR的蛋白水平的表达;通过MG-132干预A431细胞,检测敲减KTN1前后蛋白酶的活性;通过MG-132分别干预A431和HSC-5细胞,用Western blot检测敲减KTN1后泛素蛋白水平的表达;分别在A431和HSC-5中敲减KTN1后,通过Western blot检测UCH37水平的表达,Co-IP检测EGFR和泛素蛋白的相互作用。③在A431中敲减KTN1后,通过定量蛋白组学方法筛选差异性表达的蛋白质,并用qPCR在mRNA水平上验证;用qPCR在mRNA水平上筛选蛋白酶体各亚基的差异表达,并在HSC-5细胞系中验证。④在A431和HSC-5细胞中,用Western blot检测敲减KTN1后c-MYC的蛋白水平的表达,用ChIP检测c-MYC与预测启动子区的富集情况;荧光素酶报告基因实验以及敲减c-MYC后进行ChIP检测预测启动子的活性;EMSA检测启动子与c-MYC的结合情况。⑤在 A431 和 HSC-5 细胞中,用 Western blot 检测 CCDC40-ADRM1-UCH37调控轴以及对EGFR的泛素化水平影响。⑥在A431和HSC-5细胞中敲减KTN1后,检测细胞内蛋白酶体活性以及用 Western blot 和 Native gel 检测 PSMA1 的表达水平;用 Western blot 检测 KTN1对PSMA1的调控以及对EGFR蛋白表达的影响;检测细胞凋亡百分比和存活分数;裸鼠移植瘤模型验证KTN1对PSMA1的调控。⑦免疫荧光染色检测A431和HSC-5细胞中KTN1,PSMA1和ADRM1的共定位情况;Co-IP检测三个蛋白之间的相互作用;通过导入带GST标签的ADRM1全长,截短片段融合标签蛋白,Co-IP检测ADRM1与KTN1和PSMA1的结合区域。⑧裸鼠移植瘤模型验证敲减KTN1调控EGFR的通路,在临床样本中通过Western blot和免疫组织化学方法检测关键蛋白的表达。结果①敲减KTN1通过调控EGFR蛋白翻译过程减少其表达,抑制上皮鳞癌细胞系的存活并增加其凋亡比例。②KTN1通过泛素蛋白酶体途径来调控EGFR降解。③上皮鳞癌细胞系中敲减KTN1引起CCDC40,PSMA1和ADRM1的上调。④上皮鳞癌细胞系中敲减KTN1引起c-MYC的增加,c-MYC通过与CCDC40启动子的直接结合发挥转录激活作用。⑤CCDC40-ADRM1-UCH37调控轴在EGFR去泛素化调控中起关键作用。⑥体内体外实验证明PSMA1在KTN1介导的EGFR降解调控中意义重大。⑦KTN1与PSMA1和ADRM1相互作用,且竞争性结合ADRM1的1-252位氨基酸残基。⑧在体实验证明了 KTN1激发EGFR降解调控轴。结论上皮鳞状细胞癌中,KTN1的耗竭通过活化CCDC40-ADRM1-UCH37调控轴以及上调PSMA1共同影响泛素蛋白酶体途径促进EGFR的降解。