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本研究以菠萝皮渣为原料,通过微生物发酵制备果胶内切酶,并对果胶内切酶进行分离纯化及酶学特性研究,为菠萝皮渣高值化综合利用提供了一条新的途径。
本研究的主要内容和结果如下:
1、菠萝皮渣主要化学成分分析。结果如下:总糖含量6.10%,果胶1.70%,还原糖2.50%,蛋白质0.64%,脂肪0.32%,总酸2.08%,Vc 22mg/100g,水分81.57%。果胶占菠萝鲜皮渣1.70%,约占干重的9.50%,含量较高。因此,菠萝皮渣高值化综合利用可以考虑充分利用菠萝皮中的果胶,增加其附加值。
2、菠萝皮渣微生物发酵制备果胶酶。利用菠萝皮渣(干、鲜)作为原料,分别接种黑曲霉和高大毛霉,采用固体发酵、液体发酵两种发酵方式,通过比较六种发酵方法制备的果胶酶的酶比活,确定菠萝皮渣发酵制备果胶酶的方法。结果表明:以菠萝皮渣为原料的六种发酵方法均可产生果胶酶,其中干菠萝皮渣黑曲霉固体发酵酶比活最高(258.30U/mg),其次是鲜菠萝皮渣黑曲霉固体发酵(231.68U/mg),本着节省能源的原则,本研究选择以鲜菠萝皮渣黑曲霉固体发酵制备果胶酶。
3、菠萝皮渣发酵的果胶内切酶的分离纯化。菠萝皮渣发酵制备的果胶粗酶(CPPG)经硫酸铵分级沉淀获得果胶酶PPG、 Sephacryl S-300柱层析获得含有果胶内切酶的混合酶PPG<,2>、Sephadex G-75柱层析分离纯化获得电泳纯果胶内切酶EPPG(分子量:78.6KD)。菠萝皮渣果胶内切酶纯化了26倍,得率为17.8%。同时,对商品果胶酶进行分离纯化果胶内切酶,其粗酶(PG)经Sephacryl S-300柱层析分离纯化可得电泳纯的果胶内切酶EPG(分子量:37.4KD),纯化了23倍,得率为39.8%。4、菠萝皮渣发酵的果胶内切酶酶学特性研究。研究了菠萝皮渣发酵的果胶内切酶PPG<,2>和EPPG的酶学特性,同时作为比较,还研究了PG和EPG的酶学特性。
实验结果为:
(1)PPG<,2>、EPPG、PG和EPG的最适pH值分别为5.5、6.0、5.0和4.5;四种酶在pH为4.5时最稳定,随着纯度的增加,稳定性变差。
(2) PPG<,2>、EPPG、PG和EPG最适温度分别为45、40、45和35℃,随着纯度的增加,适宜的温度范围变窄;四种酶在最适温度左右下保温半小时,酶活都迅速下降。
(3)Al<3+>对PPG<,2>酶活有明显的激活作用,Fe<3+>和K<+>有明显的抑制作用;各金属离子都对EPPG酶活有抑制作用,其中Fe<3+>、pb<2+>抑制作用最强;Ca<2+>、Al<3+>、Mg<2+>、Ba<2+>和Fe<3+>对EPG酶活有明显的激活作用,pb<2+>对其酶活有明显的抑制作用。 (4) PPG<,2>、EPPG和EPG的Km分别为0.95%、0.88%和1.26%。
(5) EPG的等电点为3.12。
(6) EPG的氨基酸组成谷氨酸含量最高(49.0 mg/g),色氨酸含量最少(0.2mg/g),酸性氨基酸的含量大于碱性氨基酸。