论文部分内容阅读
非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指组织学改变与酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）相似，但排除过多酒精摄入（每周超过210g，连续五年以上）或其他特殊病因（如营养不良、药物、病毒等）的一种临床病理综合症[1]，其包括广泛的疾病谱：从单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化到肝癌[2,3]。在欧美等西方国家发达国家，普通成人NAFLD患病率为20%～33%。在美国，其在儿童和青少年中的发生率估计在5%～10%，在肥胖人群中可以高达70%[1]。近年， NAFLD在我国人群发病率逐年增加，已成为主要慢性肝病之一。然而到目前为止其致病机制尚未完全阐明。近年，大量文献报道肠道微生态和氧化应激在NAFLD发病中起重要作用[4-9]。肥胖或高脂饮食引起肠道菌群失衡产生代谢性内毒素血症，大量内毒素经门脉系统进入肝脏，刺激肝脏库普弗细胞（kupffer cells, KCs）产生大量ROS而导致氧化应激，进一步诱导NF-κB活化和肝脏炎症，最终触发胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）和NAFLD的发生，而选择性敲除KCs，即可消除这种效应。这些发现显然不同于经典的“二次打击”学说[11-15]，证实内毒素诱导KCs活化可能是NAFLD发病的始发环节。因此，抑制KCs氧化应激及下游NF-κB活化可能有助于防治NAFLD。转录因子NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor2，Nrf2）是细胞抵御内外源性氧化应激的中心环节，它可以与抗氧化反应元件(antioxidant-response element, ARE)结合，通过上调抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达而降低氧化应激损伤[16,17]。我们前期的研究证实，姜黄素可以通过诱导Nrf2核转位对NASH发挥保护作用。但Nrf2是否可以通过抑制KCs氧化应激水平，并进一步降低下游NF-κB信号通路活化而延缓NAFLD的发生，目前尚不明确。因此本实验利用姜黄素诱导Nrf2核转位，探讨其对内毒素诱导KCs氧化应激及下游NF-κB信号通路活化和炎症反应的作用，从而从KCs角度阐明Nrf2对NAFLD的保护作用及机制。目的体外通过LPS刺激KCs产生氧化应激，观察NF-κB的表达及下游炎症因子变化；通过姜黄素干预，研究Nrf2对LPS诱导KCs时氧化应激水平、II相酶（HO-1）表达、NF-κB活化及下游炎症因子表达的影响，从而为阐明NAFLD的发病机制提供实验和理论依据。方法1．SD大鼠肝脏KCs的分离、培养与鉴定。2．将KCs分为对照组与LPS组，对照组常规培养，LPS组给予LPS刺激。酶标法检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平；细胞免疫荧光法检测NF-κB的核转位情况，Western blot法检测NF-κB（p65）、IκBα、p-IκBα表达变化，ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的表达变化。3．将KCs分为对照组、LPS组和姜黄素组，对照组常规培养，LPS组给予LPS刺激，姜黄素组先给予姜黄素干预，余处理同LPS组。细胞免疫荧光法检测Nrf2的核转位情况，RT-PCR法检测抗氧化酶HO-1的表达，余指标同上。结果1．在密度梯度离心法基础上加以改良，分离、培养并鉴定KCs，证明用上述方法成功地获取KCs。2．LPS组MDA水平较对照组显著增高（P＜0.05），而GSH水平显著低于对照组（P＜0.05）。细胞免疫荧光和Western Blot结果显示，与对照组相比，LPS组胞核NF–κB表达显著升高；ELISA结果显示，LPS组TNF–α、IL–1β和IL–6表达显著高于对照组（P＜0.05）。3．酶标法结果显示，LPS组中MDA表达水平明显高于对照组（P＜0.05），姜黄素组显著低于LPS组（P＜0.05）但仍显著高于对照组；LPS组GSH表达水平显著低于对照组（P＜0.05），姜黄素组GSH表达显著高于LPS组（P＜0.05），但显著低于对照组（P＜0.05）。细胞免疫荧光结果显示，LPS组胞核Nrf2表达高于对照组，而姜黄素组高于LPS组；RT–PCR法结果显示，LPS组HO–1mRNA表达显著高于对照组（P＜0.05），姜黄素组HO–1mRNA表达显著高于LPS组（P＜0.05）；Western Blot的结果显示，LPS组NF–κB p65表达显著高于对照组（P＜0.05），而显著低于姜黄素组（P＜0.05）； ELISA法结果显示，LPS组TNF–α、IL–1β和IL–6表达显著高于对照组（P＜0.05），但较姜黄素组显著降低（P＜0.05）。结论本实验在密度梯度离心法基础上加以改良，分离、培养及鉴定大鼠KCs，成功获取KCs；证实LPS能够增加KCs内氧化应激水平，促进KCs的NF-κB的核转位及下游炎症因子TNF–α、IL–1β和IL–6表达，同时证实姜黄素引起的Nrf2的核转位能够通过上调HO-1的表达降低氧化应激水平、从而抑制NF-κB的活化及下游炎性因子的分泌，为以Nrf2和肝脏KCs为靶点防治NAFLD提供新的理论依据和实验基础。