恶性肿瘤的个普遍特征是细胞的糖基化修饰发生了显著的变化。肿瘤细胞表面糖蛋白糖基化形式的改变，对肿瘤细胞的粘附、侵袭、转移等过程起重要作用。目前已证实，对肿瘤细胞膜特征糖链结构变化规律及其调控机制的研究，具有重要的肿瘤临床诊断和治疗方面的价值。CD147是种广泛表达于造血及非造血细胞系，分子量约为43-66kDa的跨膜糖蛋白，其广泛表达以及与其他蛋白的相互作用使之能够参与多种不同的生理病理过程，并与某些重要疾病如肿瘤、炎症等的发生发展密切相关。CD147在多种肿瘤细胞、组织高表达。功能研究发现，其通过诱导周围成纤维细胞及肿瘤细胞自身产生多种基质金属蛋白酶（MMPs，包括MMP-1、MMP-2、MMP-9）降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的浸润和转移。高度的糖基化修饰是CD147分子的重要特征之。大量研究结果表明，各种癌组织、细胞中，CD147分子普遍高表达，并伴随高度的糖基化。CD147分子的糖基化修饰非常丰富，糖链约占总分子量的半。目前的研究表明，肿瘤细胞中CD147的糖基化修饰对其诱导基质金属蛋白酶的分泌可能有重要意义，从而影响肿瘤的发生发展。但是，现有的关于CD147糖基化的研究还较少且并不深入。尤其是CD147分子肿瘤相关性糖基化修饰的结构、发挥功能的糖基化位点、CD147的糖基化修饰在肿瘤进展中发挥功能的机制还有待进步明确。研究CD147分子的N-糖基化修饰的组分及其功能，对基于靶向CD147分子的肿瘤诊断和治疗具有重要意义。本课题拟明确CD147蛋白N-糖基化修饰的结构特点；通过突变CD147的三个糖基化位点进行CD147糖基化的功能研究；对CD147的肿瘤相关性糖组分β1，6N-乙酰胺基葡萄糖分支成分进行功能研究，阐明CD147的β1，6分支在肿瘤进展中的意义；揭示肿瘤细胞中，EGFR信号通路参与调节CD147分子的两种糖基化形式（HG-CD147和LG-CD147）的转变。第部分：人肺癌组织中天然CD147蛋白的纯化、鉴定及糖基化结构的质谱解析。首先我们从人的肺鳞癌组织中，免疫亲和层析法纯化天然的CD147蛋白。对纯化的蛋白进行电泳和免疫印迹鉴定，并通过糖苷酶处理、凝集素印迹初步明确其糖基化修饰特点：根据分子量的不同，CD147主要有两种糖基化形式（HG-CD147和LG-CD147），且均为N-糖基化修饰；CD147蛋白含有二分或三分形式的复杂型糖结构；高糖基化形式的CD147含有肿瘤相关糖糖组分：β1，6N-乙酰胺基葡萄糖分支。蛋白样品冻干并送至美国佐治亚大学复合糖结构研究中心进行糖结构的质谱解析，发现CD147的N-糖基化由系列高甘露糖型和复杂糖型的寡聚糖组成，并且含有与肿瘤转移密切相关的糖成分：核心岩藻糖和唾液酸。第二部分：肺癌组织中天然CD147蛋白的寡聚状态及其诱导基质金属蛋白酶的活性。通过比较肺癌组织中纯化的天然CD147真核蛋白和原核的非糖基化的CD147蛋白在溶液中的寡聚形式，我们发现真核的天然CD147蛋白在溶液中完全以寡聚形式存在；而原核的非糖基化的CD147蛋白大部分以单体形式存在，只有小部分可在溶液中形成寡聚体，提示糖基化修饰可能对维持CD147分子的高级空间结构起重要作用。进步用明胶酶谱法比较真核CD147蛋白和原核蛋白诱导基质金属蛋白酶的活性，发现真核CD147蛋白能更有效的诱导MMPs的分泌。表明糖基化的真核CD147蛋白的高级空间构象，对CD147诱导基质金属蛋白酶的活性可能有重要意义。第三部分：CD147糖基化位点突变的功能研究。通过定点突变CD147的三个N-糖基化位点（N44Q、N152Q、N186Q），我们发现在细胞内蛋白成熟的过程中，糖基化修饰对CD147蛋白在内质网的正确折叠和向质膜定位有重要意义。其中突变第二个糖基化位点(N152Q)后，显著抑制其向质膜转运，且N152Q-CD147滞留在内质网中，未折叠蛋白反应（UPR）的标志蛋白表达增高。突变CD147的糖基化位点能显著抑制肿瘤细胞促进基质金属蛋白酶的分泌，降解基质的功能。第四部分：CD147的肿瘤相关性糖组分β1，6N-乙酰胺基葡萄糖分支的功能研究。β1，6N-乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)分支的寡聚糖,是UDP-乙酰氨基葡萄糖α-甘露糖β1–6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(糖基转移酶V, GnT-V)催化形成的产物,大量研究结果表明，这种分支结构是参与肿瘤转移和恶性转型的关键糖结构。通过构建稳定转染糖基转移酶V的肝癌细胞株，我们发现过表达GnT-V能够使质膜上和肿瘤细胞培养上清中的CD147增多，从而CD147诱导的基质金属蛋白酶的活性增强，而抑制β1，6分支形成的苦马豆碱能够抑制这过程。第五部分：EGFR信号通路对CD147糖基化的调节作用。我们发现表皮生长因子（EGF）和双调蛋白(AR)作用于肝癌细胞株，短时间内能够促进CD147基因和蛋白水平的表达；而EGFR信号通路的抑制剂PD153035和ZD1839能够抑制CD147的糖基化水平，随着作用时间的延长，HG-CD147减少而LG-CD147增多，同时，CD147的细胞定位发生变化，EGFR信号通路的抑制剂PD153035和ZD1839导致CD147在胞内聚集而质膜上的CD147减少。综上所述，本研究对CD147分子糖基化修饰的结构进行鉴定和功能研究，明确了CD147蛋白N-糖基化的结构特点和肿瘤相关性糖组分，揭示了糖基化修饰可能参与调节CD147分子的胞内成熟、质膜转运过程及其寡聚状态，并可影响CD147诱导的基质金属蛋白酶的活性。本研究从糖基化修饰的角度，阐明肿瘤相关抗原CD147分子促进肿瘤发展的机制，为基于靶向CD147分子的肿瘤诊断和治疗提供新的线索。