目的:(1)优化人外分泌汗腺细胞(sweat gland cells,SGCs)的分离方法,以高效地获取原代汗腺细胞。(2)建立体外诱导人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向汗腺样细胞分化的共培养体系,并观察诱导后细胞形态、表型和相关基因表达的改变。(3)探讨DNA甲基化在BM-MSCs向汗腺样细胞转分化过程中的调控作用,并寻找甲基化调控的靶点基因。方法:(1)取新鲜的全皮层组织,剪成小块微粒,分别用不同的方法(胰酶+胶原酶,单纯胰酶,单纯胶原酶)消化分离汗腺,观察消化过程中出现游离汗腺的时间;微量移液器挑取游离汗腺,进行体外培养,观察细胞的贴壁情况和生长状态;9天后,流式细胞仪检测存活下来的细胞的增殖能力,并利用免疫细胞化学检测汗腺细胞的表面抗原CK7和CEA的表达状况。(2)购买骨髓间充质干细胞系,体外培养、扩增,并进行细胞的成脂肪、成骨细胞分化能力的鉴定;选取第三代的BM-MSCs与热休克后汗腺细胞(47℃)进行Transwell+诱导因子的共培养,分别于第3、6、9天观察细胞形态学的变化,设置汗腺细胞为阳性对照组。细胞免疫荧光技术检测细胞汗腺表面抗原CK7和CEA的表达,RT-PCR和Western blot分别检测CK7、CEA在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。(3)采用Illumina 450K甲基化芯片检测转分化前后细胞的甲基化水平的变化,筛选甲基化差异性基因,随后对差异基因进行生物信息学分析(差异位点筛选、聚类层次分析、Gene Ontology、KEGG Pathway分析、生物学功能注释、蛋白-蛋白相互作用);结合预实验结果和相关文献,对若干候选基因(HDAC4、PAX6、MMP1、EDA等),用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)进行初步验证,然后通过Mass Array飞行质谱技术对特定基因位点进行重点分析;最后,构建特定基因的重组质粒,体外转染BM-MSCs,观察质粒转染后细胞表型和相关基因的表达情况。结果:(1)酶联合消化法(a组)在2h时,镜下可见较多游离的汗腺细胞;胰蛋白酶-edta法(c组)获取的细胞贴壁很差;胶原酶法(b组)在6h左右时,才有较多的游离汗腺出现。a组和b组获取后的汗腺细胞贴壁良好,生长增殖正常,流式检测结果显示:a组和b组细胞的增殖指数分别为(18±4)%和(17±6)%,无统计学差异。免疫细胞化学表型鉴定结果显示:酶联合消化组和胶原酶组获取的细胞cea、ck7阳性率未见明显差异。(2)通过多向分化潜能实验,我们证实bm-mscs可以分化为脂肪细胞和骨细胞。transwell+诱导因子共培养3天时,bm-mscs的细胞形态基本没有变化,仍呈长梭形;共培养9d后,细胞形态呈多样化,部分细胞出现近似于汗腺样细胞的改变,由诱导前的长梭形变为扁平不规则状,并且逐步聚集呈向心性生长。对汗腺样细胞进行细胞免疫荧光、rt-pcr和westernblot检测,都发现其不同程度地表达汗腺细胞表面抗原ck7、cea。(3)采用illumina甲基化芯片,在全基因组范围内初步筛选出甲基化水平明显差异的探针位点693个;甲基化差异性基因有437个基因(升高97个,下降350个);差异位点区域分布显示:主要分布在n_shore和cpgislands区域,基因区域分布主要集中在genebody和tss200区域。geneontology和keggpathway分析显示:主要涉及细胞命运界定、信号转导与基因表达、转录阻遏、外胚层发育等生物学过程。msp和massarray飞行质谱结果显示:与诱导前bm-msc相比,诱导后汗腺样细胞中hdac4的甲基化水平明显下调,与甲基化芯片结果大体一致。转染hdac4质粒载体后,免疫细胞化学和rt-pcr结果都显示cea表达明显上调。结论:(1)胰蛋白酶和胶原酶联合应用能明显缩短汗腺细胞的分离时间,且不影响细胞的增殖活性和抗原表达情况。(2)bm-mscs和热休克汗腺间接共培养体系(transwell+诱导因子)提供了适宜转分化的微环境,并且通过该方法成功的获得了汗腺样细胞。(3)作为表观遗传修饰的重要方式—dna甲基化,参与并影响着bm-mscs向汗腺样细胞转分化的过程。(4)HDAC4可能是对CEA选择性的入核转录进行调控,表现在转染HDAC4质粒后,CEA表达上调,进而影响着转分化为汗腺样细胞的生物学过程。