由指状青霉菌（Penicillium digitatum Sacc.）引起的柑橘绿霉病是采后柑橘最主要病害,目前,化学防治仍然是控制该病害的主要手段,但随着杀菌剂连续多年使用,病菌抗药性问题日益突出,严重影响病害的控制效果。筛选新型杀菌剂及其使用技术是保证柑橘采后病害有效控制的重要内容之一。嘧菌酯（azoxystrobin）属呼吸抑制类杀菌剂,在美国已经获得登记用于防治柑橘绿霉病等采后病害的防治,在我国也尚处于实验阶段。然而,迄今国内外尚未对柑橘绿霉病菌对嘧菌酯产生抗性风险、抗药性分子机制和抗性的快速检测技术开展研究。为此,本研究开展了相关工作,取得如下结果:1.柑橘绿霉病菌对嘧菌酯的敏感基线:采用孢子萌发法和生长速率法测定了2000～2006年间采自浙江衢州、杭州、金华、丽水的65个柑橘绿霉病病菌菌株对嘧菌酯的敏感性,嘧菌酯对所分析菌株的孢子萌发和菌丝生长的EC₅₀值呈单峰频次分布,分别介于0.0201～0.2600μg/ml和0.0053～0.0794μg/ml,平均值分别为0.0426±0.0304μg/ml和0.0250±0.0129μg/ml。敏感性频次分析表明该65个菌株孢子萌发和菌丝生长对嘧菌酯敏感性频率分布均符合正态分布,其EC₅₀的平均值0.0426±0304μg/ml和0.0250±0.0129μg/ml可分别作为柑橘绿霉病菌孢子萌发和菌丝生长对嘧菌酯的敏感基线。2.柑橘绿霉病菌对嘧菌酯产生的抗性风险:通过对自发突变和紫外诱导突变菌株在含嘧菌酯的培养基上的定向选择,发现柑橘绿霉病菌对嘧菌酯抗性的自发突变频率为2.5×10^-7,20W紫外光,距离30cm直接照射60～90s条件下的突变频率为1.91×10^-7。对5个自发突变体和23个紫外诱导突变体抗性的稳定性和抗性程度分析表明,每个突变体的抗药性能稳定遗传。所有突变体的MIC（完全抑制生长的最低浓度）高于1000μg/ml,是原始菌株的1000倍以上。比较离体条件下抗嘧菌酯突变体和原始菌株的菌丝生长能力、产孢能力发现,5个自发突变体中的2个,23个紫外光诱导突变体中的3个保持与原始菌株一致的菌丝生长能力和产孢能力。通过比较柑橘绿霉病菌细胞色素b基因（Pdcytb）第一个突变热点（aa120-160）区间的PCR和RT-PCR产物长度,发现Pdcytb在该区间不存在内含子。由此可以推测,柑橘绿霉病菌对嘧菌酯产生抗药性的风险很高。3.柑橘绿霉病菌抗嘧菌酯的分子机制:通过对嘧菌酯靶蛋白细胞色素b基因（Pdcytb）aa120-160区域编码序列测序,进而比较突变菌株和原始菌株的核苷酸序列,以及推导的蛋白序列的异同,发现所有突变体的Pdcytb该段编码序列中只有一个核苷酸突变为C,而相应的原始菌株则为G,由此导致143氨基酸由甘氨酸突变成了丙氨酸（G143A）。结合已报道的多种病原菌对嘧菌酯的抗药性分子机制,可以确定柑橘绿霉病菌对嘧菌酯抗药性的产生是由于Pdcytb 143位氨基酸的点突变所引起。4.AS-PCR检测抗药性体系建立:根据柑橘绿霉病菌对嘧菌酯的抗药性机制,设计针对抗性突变体的正向引物3条,通过对每条引物的退火温度、MgCl₂和Taq酶浓度的优化,最终筛选出特异性强、检测灵敏度高的引物1条,以及与之匹配的PCR反应体系和反应参数。即引物为cytbMF2,5’-CAAATGAGTTTATGACCA-3’,反应条件:PCR反应体系（20μl）为:Buffer（10×）2μl,dNTP（2mM）2μl,MgCl₂（2.0mM）1.6μl,Taq酶（5u/μl）0.2μl,cytbR1（5μM）2μl,cytbMF2（5μM）2μl,ddH₂O补足20μl,基因组DNA模板（浓度不小于0.0610 ng/μl）1μl;PCR反应程序为:95℃预变性5min,95℃30s、56℃30s、72℃20s、共35个循环,72℃10min后结束。cytbMF2在上述条件下能够稳定、可靠地检测嘧菌酯抗性菌株,20μl反应体系可检测DNA模板的灵敏度达0.0610 ng。