随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，冠心病心肌梗死（myocardial infarction，MI）的发病率逐年上升。尽管医疗保健的改善和急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的规范化治疗及管理大大减少了冠心病的早期死亡率，但是存活者的慢性心衰的发病率大大增加。目前对于MI及其后的心衰治疗主要包括药物治疗、介入治疗以及手术治疗，但这些措施都不能使心肌细胞再生或代偿梗死后心肌细胞的不可逆减少，即不能从根本上解决心衰。因此，针对心肌的再生治疗，从而改善心功能及预后是未来心血管治疗的关键。而干细胞由于其自我更新和多潜能这两个关键特征而成为再生医学最有前途的工具。其中间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)，是干细胞家族中的重要成员，可以在一定的诱导条件下分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌、血管内皮细胞等，且经过连续传代培养及冻存后仍具有多项分化潜能。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)由于其取材方便、易于获得及无伦理学争议等优点而日渐受到人们的重视。大量研究表明， MSCs能够修复心肌损伤，增加新生毛细血管，从而改善心功能及预后。但在实际应用中，由于病变心脏低氧引起移植后MSCs的存活率非常低，极大地限制了干细胞移植治疗的效果。因此，如何提高MSCs的抗低氧能力，增加其移植后的存活率是决定干细胞移植疗效的重要因素之一。研究证明，低氧预处理可有效改善干细胞移植治疗MI的预后，但迄今为止，有关干细胞低氧预处理的最佳低氧浓度和时间尚无定论，低氧预处理改善干细胞移植疗效的机制也远未阐明。近年来，由于发现微小核苷酸（microRNAs, miRNA, miR)对基因具有转录后调控的作用，生命科学领域掀起对其研究的热潮。miRNA广泛存在于多细胞动物或植物中，是一种由基因的内含子、miRNA独立转录单位或基因簇编码的内源性单链RNA，包含19-25个核苷酸。它们通过在转录后水平使靶基因的翻译沉默，从而对生物体基因表达起到精细调节的作用。研究表明，心血管疾病、干细胞分化和自我更新等多种生理病理过程都受到miRNA的调控。同时，部分miRNA的表达受低氧调控。但是有关低氧预处理改善干细胞移植作用是否受miRNA调控尚不清楚。本研究旨在通过细胞学、功能学、基因芯片以及病毒转染等方法探讨低氧预处理hUC-MSCs移植对AMI家兔心功能的影响及其机制。本研究分为三部分：（1）通过细胞学、功能学和病理学等方法确定hUC-MSCs低氧预处理的最佳氧浓度，以及hUC-MSCs移植对梗死后后心脏功能的改善；（2）通过细胞培养、流式细胞术、激光共聚焦等技术探讨低氧预处理对体外5-AZA诱导hUC-MSCs向心肌样细胞的分化，以及低氧预处理hUC-MSCs和心肌样细胞抗化学性低氧损伤作用；（3）应用基因芯片、病毒转染及RTq-PCR等方法，筛选hUC-MSCs低氧预处理后明显变化的miRNA，探讨miRNA在hUC-MSCs抗化学性低氧损伤保护中的作用。第一部分低氧预处理的人脐带间充质干细胞移植对急性心肌梗死兔心脏重构及心室功能的影响目的：通过细胞学、功能学和病理学等方法确定hUC-MSCs移植中干细胞低氧预处理的最佳氧浓度，以及hUC-MSCs移植对梗死后心脏功能的改善。方法：采用贴壁法分离培养hUC-MSCs，并经流式细胞术检测及多向诱导分化鉴定，经不同浓度低氧(1%O2、3%O2和5%O2)和常氧（21%O2）预处理并经Brdu标记72小时。30只雄性纯种新西兰大耳白兔，随机分为假手术（sham）组、空白对照（control）组、常氧组、1%低氧组、3%低氧组和5%低氧组等6组，每组5只动物。利用结扎家兔冠状动脉左前降支方法制备AMI模型。常氧组及低氧组动物在冠脉结扎半小时后于梗死边缘及中心区5个点分别注入含预处理干细胞的培养液（每点0.01ml，含约0.05x107个hUC-MSCs）。Control动物注入不含干细胞的培养液。Sham动物只做开胸手术，不做结扎冠脉和注射干细胞处理。分别于术前、术后1日、1周和4周测定动物12导联心电图及心脏彩超以评价心功能，并每周定时测量动物体重和一般情况。移植后4周，动物在麻醉状态下，通过静脉注射10%氯化钾诱导心脏停搏于舒张期。开胸、暴露心脏、取材，通过组织学方法测定心脏梗死面积、纤维化程度、新生毛细血管密度及移植后干细胞存活数量。结果：1培养的hUC-MSCs不表达HALDR、CD34、CD45，强表达CD90、CD105，具有多向分化性，经特定培养液可向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞进行分化。2在低氧（1%O2、3%O2、5%O2）环境下，hUC-MSCs增殖速度显著快于常氧（21%O2）条件，尤其在3%低氧条件下增长更显著，并随时间延长而速度加快（P<0.01）。1%低氧和5%低氧条件下的MSCs增殖速度无显著性差异（P>0.05）。3术后第3、4周时，各干细胞移植组动物体重增长均大于Control动物，低氧组动物增长大于常氧组动物，尤以3%低氧组动物更明显（P<0.05），且与Sham组动物无显著性差异（P>0.05）。4在整个实验过程中，各组动物的右房左右径(RAD)、右室舒张末期左右径(RVEDd)、室间隔舒张期厚径(IVST)和左室后壁舒张期厚径(LVPWT)均无明显变化。各手术组动物手术前、梗死后1天和1周的左房前后径(LAD)、左室舒张末期前后径(LVEDd)和左室射血分数(LVEF)均无统计学差异（P>0.05）。梗死后4周时，Control组动物的LAD和LVEDd显著大于其他各组，而LVEF显著低于其他各组（P<0.05）;常氧组动物LAD和LVEDd显著大于各低氧组动物，而LVEF显著低于各低氧组动物(P<0.05);1%和5%低氧组动物LA和LVEDd均显著大于3%低氧组动物，而LVEF均显著低于3%低氧组动物(P<0.05)；5%与1%低氧组动物的LAD、LVEDd和LVEF无统计学差异（P>0.05）。5Control动物的MI面积和心肌纤维化面积显著大于hUC-MSCs移植各组动物(P<0.05)；低氧各组动物的MI面积和心肌纤维化面积显著低于常氧组动物，其中尤以3%低氧组动物更明显（P<0.05）。Control动物的梗死周边区新生血管和梗死区域干细胞存活数显著低于hUC-MSCs移植各组（P<0.05）；低氧各组动物梗死周边区新生血管和梗死区域干细胞存活数显著高于常氧组，其中尤以3%低氧组动物更明显（P<0.05）。小结:1hUC-MSCs心脏移植可明显减轻家兔左房、左室重构，减少梗死面积和梗死后恢复期纤维化，增加心肌血管密度，改善梗死后心脏的泵功能。21%、3%和5%低氧预处理可显著增加培养hUC-MSCs的数量和质量；低氧预处理hUC-MSCs心脏移植的效果明显增加，其中3%低氧预处理hUC-MSCs的作用最为显著。第二部分低氧预处理对人脐带间充质干细胞及体外诱导分化心肌样细胞的影响目的:通过细胞培养、流式细胞术等方法探讨低氧预处理对体外5-AZA诱导hUC-MSCs分化为心肌样细胞的影响，以及低氧预处理对hUC-MSCs及其诱导的心肌样细胞抗化学性低氧损伤的保护作用。方法:将已分离纯化的hUC-MSCs分为常氧组和低氧组两组，分别给予21%O2常氧和3%O2低氧预处理，并给与不同浓度5-氮胞苷（5-AZA）诱导干细胞分化。4周后应用SP法进行cTnI免疫组化染色测定干细胞分化率；流式细胞术测定其肌钙蛋白含量及细胞周期；并通过透视电子显微镜观察诱导分化细胞的超微结构。对干细胞及诱导分化28天的心肌样细胞给以100μmol/LCoCl2以诱导化学性损伤，采用激光共聚焦方法分别测定CoCl2前后干细胞及诱导分化心肌样细胞的hUC-MSCs及诱导分化28天心肌样细胞的线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨM)和线粒体Ca2+([Ca2+]m)。结果：1低氧预处理可促进5-AZA诱导hUC-MSCs转化为心肌样细胞，使cTnI生成量显著增高（P<0.05）。此作用具有明显的浓度依赖性，在较低5-AZA浓度下无作用，而过高浓度5-AZA可对干细胞产生毒性作用。2低氧预处理对hUC-MSCs的细胞周期没有影响，但是对于心肌样细胞的细胞周期分布有显著性影响，使G1期细胞的比例显著减少，G2期和S期细胞比例均显著增多（P<0.05）。3未经5-AZA诱导的干细胞不存在肌丝。经5-AZA诱导后的心肌样细胞内可见数量不等的核旁肌丝形成，低氧预处理诱导细胞内的肌丝密度明显大于常氧预处理诱导细胞。4干细胞与经5-AZA诱导的心肌样细胞的ΔΨM、[Ca2+]m无显著性差异。与常氧预处理相比较，低氧预处理hUC-MSCs及心肌样细胞的ΔΨM显著增高，[Ca2+]m显著降低（P<0.01），这种差异在化学性缺氧损伤后依然存在（P<0.05）。经析因方差分析，氯化钴、5-AZA、氧浓度均为影响ΔΨM的独立影响因子（氯化钴、氧浓度P<0.01，5-AZA P<0.05）；氯化钴、5-AZA为影响[Ca2+]m的独立影响因子（P<0.01）。5-AZA影响不显著（P>0.05）。小结:1低氧预处理可显著促进5-AZA诱导hUC-MSCs向心肌样细胞分化，使诱导的心肌样细胞产生更多肌钙蛋白和肌丝,此作用具有明显的浓度依赖性。2低氧预处理可增强hUC-MSCs以及5-AZA诱导的心肌样细胞抗化学性低氧损伤的能力，对抗氯化钴对细胞ΔΨM的降低和钙离子的升高。第三部分低氧预处理对人脐带间充质干细胞的微小RNA谱系的影响及miRNA-210、-21上调、miRNA-363下调对其耐受化学性低氧损伤的保护作用目的:应用基因芯片、病毒转染及RTq-PCR等方法，筛选hUC-MSCs低氧预处理后明显变化的miRNA，探讨miRNA在对hUC-MSCs抗化学性低氧损伤的保护作用,以揭示低氧预处理改善AMI后干细胞移植疗效的机制。方法:利用基因芯片对低氧(3%O2)和常氧（21%O2）预处理的hUC-MSCs进行miRNA谱系定量的测定，筛选出具有显著差异的miRNA并应用PCR验证。利用病毒携带特定miRNA模拟物或抑制物转染入hUC-MSCs。应用共聚焦技术测定化学性缺氧损伤后各组干细胞的ΔΨM及[Ca2+]m。结果：1低氧预处理后共有78个miRNA发生显著变化,上调的有29种，下调的有49种(P<0.05)。其中miRNA-21和miRNA-210上调较为显著， miRNA-363下调较为显著。2miRNA-210和miRNA-21上调，以及miRNA-363下调对干细胞ΔΨM和[Ca2+]m无显著影响。Cocl2化学性低氧可引起Control干细胞明显损伤，表现为ΔΨM明显降低和[Ca2+]m明显升高（P<0.05），但miRNA-210和miRNA-21上调的干细胞、以及miRNA-363下调的干细胞的ΔΨM和[Ca2+]m未出现明显变化（P>0.05）。小结:1低氧预处理可明显上调hUC-MSCs miRNA-21和miRNA-210，下调miRNA-363。2miRNA-210和miRNA-21的上调，与miRNA-363的下调可增强hUC-MSCs对抗化学性低氧损伤，发挥保护作用。