肺和胃肠道一样，也是一个内分泌器官，存在着一类具有特殊形态、功能且与神经系统具有密切关系的内分泌细胞群。Fieyter于1938年观察到并命名的亮细胞是人们最早认识的肺神经内分泌细胞（pulmonary neuroendocrine cell，PNEC）。在这之后，随着研究手段的不断提高，人们对这类细胞的认识逐渐加深。上世纪60年代后期，Pearse等根据肺神经内分泌细胞的功能特点将其归入APUD细胞系统。80年代后期Pearse又提出将肺归为弥散神经内分泌系统（diffuse neuroendocrine system，DNES）。近二十多年来，肺神经内分泌细胞的来源、结构、功能、激素的表达及其与肺神经内分泌肿瘤的关系越来越引起专家们的重视。数十种广泛存在于中枢和周围神经的神经活性物质诸如降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、5-羟色胺(5-hydroxy-tryptamine，5-HT)、P物质(substance P，SP)和甲硫氨酸脑啡肽(methionineenkephalin，M-ENK)等不断被人们发现。同时，在呼吸道内也已发现多种具有生物活性作用的肽类或胺类物质。它们对肺的运动、感觉、分泌、营养、代谢及防御等功能活动具有保护及调节作用，被认为是中枢神经系统与肺之间的一类重要信息物质。并认为主要来自支配气道的非肾上腺素能、非胆碱能神经纤维(Non-adrenergic、Non-cholinergic，NA、NC)——即有些研究者所称的第三神经系统。近年来，有学者提出肺自身的调节也应是一个非常重要的环节。从而，肺自身是否具有合成和分泌某些肽类物质的能力，这些生物活性物质之间是否具有关联性，如何参与肺的生理、病理过程等问题引起越来越多学者的关注。神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是近年来众多学者十分关注的神经递质和神经调质之一，主要存在于弥散神经内分泌系统的中枢部——下丘脑，并与摄食、血压、心率、呼吸调节、平滑肌舒缩以及下<WP=5>丘脑神经内分泌功能等重要生理过程的调节密切相关，同时NPY也被发现存在于胰腺等外周器官并被证实有收缩血管的作用。那么NPY是否也存在于肺内？肺内分泌细胞能否合成NPY？NPY在肺内的作用及与其他活性物质的关系是怎样的？这成为本课题设计的一个目的。国内外学者对肺神经内分泌细胞进行的一系列观察和报道发现，肺神经内分泌细胞在胚胎发育过程中异常活跃，与其在正常成体肺组织存在很大的差异。因此，对动物肺内NPY、5-HT、CGRP所表达的增龄变化的观察将有助于我们对肺的发生、发育的全面了解。本课题以嗜铬颗粒蛋白A，即嗜铬素A(chromogranin A，CgA)作为肺神经内分泌细胞的特异性标记物，首先从翻译和转录两方面对NPY在肺内的表达进行了研究；同时对NPY与5-HT、CGRP和CgA在肺神经内分泌细胞内的关系进行了观察。然后对增龄大鼠肺内NPY、5-HT和CGRP表达的变化进行了动态观察。晚近的研究认为，肺神经内分泌肿瘤与胚胎肺发育中神经内分泌细胞有某些相似之处。因此，我们对NPY在肺神经内分泌肿瘤的表达进行了观察，以期为肺内分泌肿瘤发生的病理学提供实验资料。CgA由于能与特异性激素结合而广泛存在于神经内分泌细胞及其肿瘤的内分泌颗粒中，被认为是神经内分泌细胞和神经内分泌肿瘤特异、敏感、可靠的标记物。在神经内分泌癌的病理诊断学上具有十分重要的意义。本实验中用CgA作为肺神经内分泌细胞的特异性标记物，观察CgA与NPY、5-HT、CGRP在肺NEC中的关系；比较CgA与其他标记物在人肺神经内分泌肿癌中阳性表达的情况，以期为肺内分泌肿瘤的临床病理诊断提供一定的形态学参考。第一部分：NPY与5-HT、CGRP、CgA在大鼠肺组织的表达目的：观察大鼠肺内NPY免疫反应阳性物质的表达情况；观察NPY同CGRP、5-HT、CgA免疫反应阳性细胞的关系。初步探讨这些活性物质之间的关联性，为揭示肺的内分泌机制、进一步认识肺的结构和功能提供形态学资料。 方法：应用免疫组化单标、免疫荧光双标和原位杂交技术，利用光镜、透射电镜和激光共聚焦扫描显微镜进行观察、照相。光镜、激<WP=6>光共聚焦扫描显微镜切片制备：选用健康新生和孕20日SD大鼠各6只，雌雄不限。新生大鼠结扎气管后迅速断头放血，行Bouin液气管灌注，再全肺固定1小时。待肺组织稍稍变硬后，选取带有各级支气管的左上肺组织多块，置入相同的固定液中固定；孕鼠活杀后迅速打开子宫，取出活胎鼠，打开胸腔取全肺浸入新配制的Bouin液固定。常规石蜡包埋、连续切片，片厚6μm。分别进行以NPY、5-HT、CGRP和CgA为一抗的免疫组织化学染色；按一抗不同种属来源分别进行CGRP与NPY、CGRP和5-HT；CgA与NPY、CgA和5-HT荧光双标免疫组织化学染色；以NPY寡核苷酸为探针进行原位杂交。透射电镜样品制备：实验动物秤重、麻醉后，取材步骤同上，固定液采用2.5%戊二醛，肺组织取材后切为1mm3的细块。投入相同的固定液中，室温下固定48小时。将组织块经PBS充分冲洗，1%锇酸后固定。丙酮梯度脱水，Epon812包埋。Leica超薄切片机切片，片厚70nm。枸橼酸铅和醋酸铀染色，日立H-7500型透射电子显微镜观察。结果：1.光镜观察结果：①NPY免疫反应阳性细胞以单个神经内分泌细胞（NEC）多见，而神经上皮小体（NEB）较少，在肺内支气管树的粘膜