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哺乳动物的肠道中存在着数以万亿计的微生物参与宿主的机体代谢,肠道黏膜免疫系统是机体整个免疫网络的重要组成部分,避免了肠道组织与外界抗原和微生物的直接接触,是机体抵抗感染的第一道防线。Science杂志研究表明,覆盖在肠上皮细胞上的粘液层也可以将细菌与肠道上皮组织分隔开来从而达到保护肠道的目的。抗菌肽是肠道上皮内的潘氏细胞分泌的一种重要的抗菌物质,其作为粘液层内的重要成分,可以使机体肠道避免与肠道内细菌直接接触,从而更好地保护宿主免受细菌侵扰。肠道上皮内的MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)信号是机体阻止细菌入侵的关键信号通路,当肠上皮缺失MyD88后,肠上皮细胞不能产生RegⅢγ,覆盖在肠上皮细胞上的粘液层也会消融,从而使宿主肠道上皮与肠道菌群直接接触,增加了细菌感染的机会。本研究发现肠上皮缺失MyD88的小鼠口服感染一定剂量的鼠伤寒沙门氏菌后,能够再次诱导肠上皮产生大量的抗菌肽来保护宿主,同时研究也发现小鼠肠道固有层ILC3(Type 3 innate lymphoid cell,ILC3)以及CD4+T细胞分泌IL-22的水平显著升高。我们认为肠道正常菌群通过肠上皮MyD88信号诱导肠道黏膜抗菌免疫,而沙门氏菌的感染能够刺激DC分泌IL-23,诱导小鼠肠道固有层ILC3以及CD4+T细胞分泌IL-22,进而刺激肠上皮中的潘氏细胞分泌高水平的RegⅢγ,抵抗沙门氏菌的感染。本课题将从以下几个方面进行研究。1.肠上皮缺失MyD88(即Villincrere x MyD88FL/FL)小鼠杂交成功首先我们从Jackson lab购买了MyD88FL/FL和Villincre转基因小鼠,将两种转基因小鼠进行杂交,获得肠上皮特异性缺失MyD88的小鼠,即Villincrere x MyD88FL/FL小鼠。荧光定量PCR检测分选的小鼠肠道上皮细胞MyD88表达情况,结果表明,KO小鼠的肠道上皮细胞中MyD88未检测到表达,基因敲除小鼠杂交成功。2.使用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium,S.Typhi)感染Villincrere x MyD88FL/FL小鼠分别取数只WT小鼠和KO小鼠,每只小鼠口服感染S.Typhi,剂量为1x108个单菌落,每日监测小鼠的体重及死亡情况后发现,WT组和KO组的小鼠在这两方面的差异并没有统计学意义。另外构建3天的感染模型,方法与之前相同。检测血清中的IFN-γ发现,感染组小鼠的表达水平显著高于未感染组,但感染组KO小鼠的表达量低于WT组,同时还发现肠道固有层中的Treg(Regulatory T cell,Treg)的比例和数量显著降低。检测小鼠的肠上皮中抗菌肽的表达情况,结果发现在感染鼠伤寒沙门氏菌后,肠上皮缺失MyD88的小鼠的抗菌肽与未感染对照组相比,表达量显著升高。3.Villincrex MyD88FL/FL小鼠感染S.Typhi后检测IL-22+ILC3以及CD4+T细胞的比例和数量显著升高将Villincrex MyD88FL/FL小鼠的WT组和KO组如之前之方法构建模型,3天后检测两组小鼠肠道固有层的IL-22+ILC3以及CD4+T细胞的比例和数量均有显著性升高。4.DC亚群以及巨噬细胞缺失对小鼠抗S.Typhi感染的影响分别对Langerin-DTA小鼠、Batf3-/-小鼠及CX3CR1GFP/GFP小鼠(分别缺失CD103+CD11b+DC、CD103+DC以及巨噬细胞),给予口服感染S.Typhi,实验结果表明,Langerin-DTA小鼠和Batf3-/-小鼠在体重变化方面没有差异,而CX3CR1GFP/GFP小鼠的WT组和KO组体重差异显著,但三种小鼠死亡率在各组之间没有差异。本研究发现机体感染沙门氏菌后,肠上皮中MyD88信号并不是抗感染的主要参与者,而是启动了机体免疫反应来抵抗细菌感染,为研究沙门氏菌抗感染免疫应答提供了一个新的方向。