扩展青霉(Penicillium expansum)引起的青霉病害是苹果采后主要病害,不仅导致苹果的腐烂变质,造成巨大的经济损失;而且其产生的展青霉素严重威胁人类健康。壳聚糖是一种天然多糖,具有激发植物抗性和抑制病原微生物效应,因而在果蔬采后病害防治中有着广泛应用。本实验室前期研究结果显示壳聚糖可显著抑制扩展青霉,且通过一种能量依赖方式的吸收转运到细胞内,暗示着可能存在胞内抑菌模式。本论文采用反向遗传和生化细胞分析,探究壳聚糖的跨膜转运途径及胞内壳聚糖在其抑菌过程中的作用,从胞内的维度,在分子细胞水平解析壳聚糖的抑菌作用机制。本文获得的主要研究结果如下:(1)采用三种内吞途径特异性阻断剂(盐酸氯丙嗪、染料木黄酮和盐酸阿米洛利),发现均能抑制壳聚糖向胞内的转运,且降低壳聚糖的in vitro和in vivo抑菌活性。其中,盐酸氯丙嗪和染料木黄酮、盐酸氯丙嗪和盐酸阿米洛利、染料木黄酮和盐酸阿米洛利、盐酸氯丙嗪和染料木黄酮和盐酸阿米洛利处理后,壳聚糖对青霉病害的抑制率分别下降19.3%、11.4%、3.3%和15.1%,表明壳聚糖主要是依赖网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用进入扩展青霉胞内的,且壳聚糖的吸收转运与其抑菌作用存在关联。(2)选择壳聚糖内吞途径中3个关键节点基因PeCAM、PePLD、PeEps进行基因敲除,获得了?PeCAM、?PePLD和?PeEps突变菌株。与野生型相比,突变菌株的孢子变大,菌落颜色偏绿,菌落生长速率显著上升,但菌丝体生长量下降,突变体致病力减弱,patulin的产生能力未见明显变化;与野生型相比,壳聚糖对突变菌株?PeCAM、?PePLD和?PeEps平板生长的抑制率分别下降了49.1%、62.6%和52.0%,突变菌株对壳聚糖的敏感性明显降低,进一步明确了壳聚糖的跨膜转运途径及胞内壳聚糖在抑菌过程中的作用。(3)凝胶阻滞实验表明壳聚糖可以与扩展青霉基因组DNA结合,阻滞DNA在凝胶中的迁移;紫外吸收光谱的增色效应进一步表明壳聚糖能与DNA结合,破坏DNA的高级结构;体外DNA扩增结果表明壳聚糖能干扰DNA的复制;由此推测DNA可能是壳聚糖的胞内作用靶点。