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继脑研究成为20世纪最后十年的研究重点之后,有关疼痛的研究已被美国国会列为21世纪头十年的研究重点,这反映了疼痛问题在国民生活中占有的重要性和迫切性。神经源性疼痛(neuropathic pain)是中枢或外周神经系统损伤或病变引起的疼痛综合征,以自发性疼痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperalgesia)和痛觉超敏(allodynia)为特征。其确切发病机制尚不清楚,是疼痛研究的前沿课题。到目前为止,尚没有研制出一种镇痛时间长、疗效满意、副作用少、经得起时间考验的治疗药物,因此,巧妙地合并应用已有的方法和药物,提高治疗效果,降低副作用,仍然是目前治疗神经源性疼痛的主要途径。 近年来研究表明,阿片药治疗是慢性非癌性疼痛病人安全有效的方法之一,它作为疼痛整体治疗方案的一部分,可改善病人的生活质量、恢复机体功能。但阿片药物治疗神经源性疼痛未达成一致建议,有必要进一步研究。随着人们对中枢敏感化机制的逐步认识,NMDA受体在神经源性疼痛中的地位日益受到重视。研究发现,NMDA受体能介导动物Windup现象和痛觉过敏的形成,而且NMDA受体拮抗剂可减轻吗啡耐受现象,但这些研究大多采用不用于临床的工具药(如MK-801),而且对其作用机制的研究仅局限于脊髓水平,基本上采用行为学观察指标和分子水平的检测手段。有学者临床观察发现:吗啡和氯胺酮长期鞘内给药治疗癌性疼痛效果显著,但对坐骨神经松弛结扎后的神经源性疼痛效果如何尚未见报道。本研究拟鞘内长时程应用吗啡和氯胺酮治疗大鼠神经源性疼痛(坐骨神经松弛结扎模型),对其痛行为的影响进行观察,并在细胞、分子和基因水平上探讨它们在脊髓和脊髓上水平抗伤害性作用的机制,为临床合理治疗神经源性疼痛提供理论依据。本研究共分三部分:第一部分鞘内联合应用吗啡和氯胺酮对神经痛大鼠疼痛行为的影响;第二部分鞘内联合应用吗啡和氯胺酮脊髓水平抗伤害性作用的机制。从对背根神经节感觉神经元超微结构的影响、对脊髓NO产量、NOS和AChE活性、对脊髓背角P物质含量以及对脊髓林阿片受体(MOR)和NMDA受体1(NRI)mRNA表达的影响等五个方面进行研究;第三部分鞘内联合应用吗啡和氯胺酮脊髓上水平抗伤害性作用的机制。通过对脑组织各区(大脑皮质、海马、脑干)NO产量、NOS和AChE活性、MoR和NRI mRNA表达的影响等三个方面进行研究。实验材料 1.实验动物:健康雄性Wistar大鼠,体重200一25鲍。 2.主要试剂和药品:NO和NOS、AChE测试盒、P物质免疫组化染色试剂盒、RNA裂解液、总RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒、PCR Marker、Takara试剂盒、NRI引物、MOR引物、内参照p一action、盐酸吗啡注射液、盐酸氯胺酮注射液。 3.主要仪器:U一MCB OlymPus图象采集系统;0一PPIO摄像头(日本);BX60 Olympus万能显微镜照相机(日本);METAMORP柑COOL SNAP+方AX70显微(荧光)图象分析系统;CM1800砚ICA切片机(德国);HERM-咙23 s3K低温高速离心机(德国);盯e一looPeR扩增仪(美国);KODAKID型凝胶成像系统分析仪;LKB一V型超薄切片机(瑞典);H石oo透射电镜(日本)。实验方法 1.动物模型 wistar雄性大鼠腹腔注射水合氯醛300m扩kg麻醉下,参考扬建平的方法鞘内置管,参考Bennett和xie的方法复制坐骨神经松驰结扎模型(CCI模型),术后观察3天,大鼠出现肢体感觉或运动丧失,导管脱出者不作为观察对象。 2.动物分组和给药方法 术后第四天随机分为五组,每日给药一次,连续7天。 B组(空白对照组):不做任何处理 C组(对照组):鞘内给0.9%生理盐水10讨 M组(吗啡组):鞘内给吗啡20卜g K组(氯胺酮组):鞘内给氯胺酮50林g KM组(吗啡加氯胺酮组):鞘内给吗啡10林g和氯胺酮25林g 药物用生理盐水溶成10闪,然后用0.9%生理盐水10闪冲管。 3.观察指标和方法 l)痛行为测定:将大鼠置人观察笼内,待其安静后,用辐射热刺痛仪将光辐射焦点对准右足环底中部,打开光源,以大鼠抬腿或逃走的潜伏期作为热痛闭值(PWL)。测量结果用最大镇痛效应百分率(MPE%)表示,即MPE%=(给药后痛阂一基础痛阂)/(光照截止时间一基础痛闭)x100%。用药第一天,在用药后O、5、15、30、45、60、90、12Omin测PWL的变化,每日用药30而n后测PWL值,连续7天。 2)脊髓和脑组织NO产量和NOS、AChE活性测定(酶法) 3)脊髓背角P物质含量测定(免疫组化法) 4)背根神经节感觉神经元超微结构变化(电镜) 5)脊髓和脑组织NRI mRNA、MOR mRNA表达的变化(RT一PCR法)实验结果 一、鞘内联合应用吗啡和氯胺酮对神经痛大鼠痛行为的影响 1.用药第一天热痛阂随时间的变化趋势:KM组MPE%在用药后90和120min高于M组(p<0.01)。 2.每日用药后MPE%变化:随用药次数增加,M组MPE%逐渐下降,在用药后第5、6、7d与KM组比较差异有显著性(p<0.01);KM组MPE%值没有下降趋势、M组和KM组与K组和C组比较在各时点差异均有统计学意义(p<0.01);K组和C组比较在各时点差异亦有显著性(p<0.01)。 二、鞘内联合应用吗啡和氯胺酮脊髓水平?