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肝细胞癌（HCC）是当前严重威胁我国人民健康最主要的恶性肿瘤。HCC术后的复发和转移是导致HCC患者死亡率居高不下的最主要的原因。深入研究HCC复发转移的机制和积极探索有效的抗复发转移治疗措施是当前HCC诊治中的重点和难点，意义重大。Rho（Ras homologous）蛋白是一种分子量为21K—30Kda的单体鸟核苷酸调节蛋白，近年来研究发现其所介导的细胞运动可能在恶性肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要作用。已有文献报道RhoC的表达或是活性升高与侵袭性乳癌、黑色素瘤、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌和胃癌的侵袭转移密切相关，我们先前的研究也发现RhoC的表达升高与HCC的侵袭转移成正相关，高表达RhoC的HCC患者预后较差。这些结果提示RhoC可能在HCC的侵袭转移中发挥关键性作用。但是，目前尚无研究阐明RhoC调控HCC侵袭转移的具体机制。因而，本研究的第一部分通过逆转录病毒介导的小RNA干扰技术特异性抑制肝癌细胞中RhoC的表达，探讨RhoC调控HCC侵袭转移的分子机制，同时探讨通过体内抑制RhoC的表达而抑制HCC侵袭转移的可行性。我们获得了以下研究结果：1．我们在HepG2、MHCC97-L、HCCLM3，三种侵袭转移能力依次升高的肝癌细胞系中用半定量RT-PCR的方法检测了RhoGTPase家族主要成员Rac1、Cdc42、RhoA、RhoB、RhoC mRNA的表达。用Western Blot方法检测了RhoC蛋白的表达。结果显示：RhoC mRNA和蛋白的表达水平在高侵袭转移能力的HCCLM3肝癌细胞系中明显升高。提示RhoC的高表达与肝癌细胞系侵袭转移潜能呈正相关。2．我们设计、构建了RhoC的siRNA质粒，通过逆转录病毒转染并经G418筛选，获得了稳定表达RhoCsiRNA有效片断和无效对照片断的HCCLM3细胞(HCCLM3RhoCRNAi+和HCCLM3RhoCRNAi-)。Western Blot结果显示HCCLM3RhoCRNAi+中RhoC的表达明显下调，RT-PCR结果显示在RhoC表达被显著抑制的同时，仅有RhoA的轻度升高，而Rac1、Cdc42、RhoB的表达无明显变化。这提示本研究中采用逆转录病毒介导的小RNA干扰技术有效特异地抑制了HCCLM3肝癌细胞中RhoC的表达。3．我们划痕实验的结果显示HCCLM3RhoCRNAi+较HCCLM3RhoCRNAi-细胞迁移能力明显下降；Transwell侵袭小室测定法结果显示HCCLM3RhoCRNAi+较HCCLM3RhoCRNAi-细胞侵袭能力明显下降；MTT法结果显示HCCLM3RhoCRNAi+和HCCLM3RhoCRNAi-两组细胞增殖能力差异不具有显著性意义；Annexin V和PI双染法结合流式细胞仪技术结果显示HCCLM3RhoCRNAi+和HCCLM3RhoCRNAi-两组细胞的凋亡差异不具有显著性意义。这些结果提示在体外实验中抑制RhoC的表达可以抑制肝癌细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡。4．已有研究发现Autotaxin（ATX）能够诱导肝癌细胞的侵袭转移，我们推测这一过程依赖于RhoC的参与。我们采用Transwell侵袭小室测定法确定了ATX能够诱导HCCLM3肝癌细胞的侵袭迁移；pulldown实验结果显示ATX能够诱导肝癌细胞中RhoC的活化；细胞荧光显示ATX能够诱导肌动蛋白细胞骨架（F-actin）发生形变；Transwell侵袭小室测定法显示抑制RhoC的表达可以抑制ATX诱导的HCCLM3肝癌细胞的侵袭迁移。这些结果提示RhoC参与了ATX诱导的肝癌细胞的侵袭转移。5．在HCCLM3转移性人肝癌细胞裸鼠模型的基础上，我们建立了逆转录病毒介导的RhoCsiRNA干预模型。免疫组化检测GFP和RhoC的表达情况，结果显示在转移性人肝癌细胞裸鼠模型中皮下种植产逆转录病毒的包装细胞能够感染靶细胞并有效的抑制其RhoC的表达。裸鼠肺组织连续切片计数肺转移的数目，结果显示体内抑制RhoC的表达能够抑制肝癌细胞的肺转移。连续监测皮下种植HCCLM3原发瘤的大小，结果显示体内抑制RhoC的表达能够抑制HCCLM3原发瘤的生长。免疫组化检测HCCLM3原发瘤中的微血管密度（MVD），结果提示体内抑制RhoC的表达能够抑制肝癌的生长可能与抑制肿瘤血管生成有关。我们的结果提示体内抑制RhoC的表达可以抑制肝癌细胞的转移。肝癌新生血管生成是一个多步骤、多因素、序贯的过程。新生血管生成始终且必须依赖于血管内皮细胞的迁移和运动。已有研究揭示了RhoA对血管内皮细胞的关键性作用。我们先前的研究提示RhoC可能在肝癌新生血管生成过程中起关键性作用。同时，我们在第一部分的研究中发现体内抑制RhoC的表达可以抑制肝癌细胞诱导的新生血管生成。我们推测可能的机制之一是由于新生血管内皮细胞内RhoC的表达受抑制后，内皮细胞形变运动降低导致内皮细胞不能形成血管样结构，从而使血管生成减少。结合已有的文献和我们的研究，我们相信RhoC参与了肝癌新生血管形成这一复杂过程的调控，而且RhoC的活化可能在这一过程是重要事件。因而，本研究的第二部分我们利用一系列细胞实验以及体内外新生血管生成模型，对RhoC在新生血管生成中的作用以及调控机制进行研究，获得如下结果：1．利用本研究第一部分获得的含RhoCsiRNA表达片断的逆转录病毒的上清，三重瞬时感染人微血管内皮细胞HMEC-1，荧光显微镜计数EGFP表达细胞数评价感染效率，Western blot检测RhoC蛋白表达，结果显示我们成功地抑制了HMEC-1细胞中RhoC的表达。2．我们的划痕实验结果显示HMEC-1RhoCRNAi+较HMEC-1RhoCRNAi-的迁移能力明显下降；Transwell侵袭小室测定法结果显示HMEC-1RhoCRNAi+较HMEC-1RhoCRNAi-的侵袭能力明显下降；MTT法结果显示HMEC-1RhoCRNAi+和HMEC-1RhoCRNAi-的增殖能力差异不具有显著性意义；Annexin V和PI双染法结合流式细胞仪技术结果显示HMEC-1RhoCRNAi+和HMEC-1RhoCRNAi-的凋亡差异不具有显著性意义。这些结果提示在体外实验中抑制RhoC的表达可以抑制人微血管内皮细胞HMEC-1的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡。3．我们将HMEC-1内皮细胞种植于Matrigel上构建了二维血管新生模型，结果显示抑制HMEC-1中RhoC的表达可以抑制其形成网格状结构；用结合罗丹明的鬼笔毒素特异性的标记Matrigel上内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架，结果显示抑制RhoC可以抑制内皮细胞发生形变；将HMEC-1内皮细胞包被微载体球后种植于Matrigel中构建了三维血管新生模型，结果显示抑制HMEC-1中RhoC的表达可以抑制其在三维环境中形成三维管状结构。这些结果说明体外抑制RhoC的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成。4．我们将产逆转录病毒的包装细胞种植于裸鼠皮下并成瘤，同时将混合了VEGF的Matrigel种植于裸鼠皮下做为血管新生的诱生物，建立了研究新生血管生成的体内模型。结果显示体内抑制RhoC的表达可以抑制VEGF诱导的新生血管生成。我们的研究显示RhoC通过调控肝癌细胞的迁移运动能力参与了肝癌的侵袭转移，体内外抑制RhoC的表达可以抑制肝癌细胞的侵袭转移；我们的研究同时显示抑制内皮细胞中RhoC的表达可以抑制其迁移运动，体内外抑制RhoC的表达可以抑制新生血管生成。这一研究提示RhoC可以作为治疗HCC侵袭转移的潜在的靶位点。