芦丁对乳清蛋白的共价修饰、结构鉴定与功能研究

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乳清蛋白是存在于牛乳清蛋白中的一系列球状蛋白的总称,如β乳球蛋白(β-Lactoglobulin,β-LG)、α-乳白蛋白(α-Lactalbumin,α-LA)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)。乳清蛋白被广泛应用于食品工业中的功能性成分添加。然而,在乳清蛋白的分离纯化、生产运输、储存以及生物利用的各个环节都会受到较多因素的影响,如温度、p H、湿度等变化引起的功能特性的变化,以及引起部分人群过敏,使得乳清蛋白在食品中的应用受到了限制。芦丁是一种被称为槲皮素-3-O-芸香苷和维生素P的多酚类化合物,具有丰富的营养和药理学特性。研究者常采用多糖或黄酮类小分子共价修饰来实现乳清蛋白的功能改善,但不同方法对多酚和乳清蛋白结合的影响和差异研究较少。因此,本文以乳清蛋白为研究对象,通过芦丁的共价修饰改变乳清蛋白的结构和功能,探究共价修饰后乳清蛋白的致敏性、消化特征、抗氧化性等功能特性。本文的主要研究内容和结论如下:(1)通过碱法和自由基法制备β-LG与芦丁的共价化合物(β-LG-rutin),对获得的共价化合物进行结构和功能鉴定,并通过抗氧化和ELISA实验探究其抗氧化性和致敏性变化。结果表明,碱法和自由基法均能制备β-LG-rutin共价复合物,芦丁与β-LG中的赖氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)侧链反应引起自由基团含量变化。圆二色和红外光谱证实了两种方法都改变了β-LG的二级结构,碱法处理使得β-LG-rutin以及β-LG的结构更加舒展,两种方法处理后β-LG二级结构的变化都是β折叠的增加和α螺旋的减少。碱法制备后β-LG-rutin的DPPH和ABTS自由基清除率大幅提高,分别为91.86%和84.34%。复合物中JR(碱法制备的β-LG-rutin共价复合物)抗原抑制率最高,为13.85%。(2)采用胃肠道模拟消化的方式研究了β-LG和β-LG-rutin的消化情况。自由氨基含量和粒径变化表明,β-LG及β-LG-rutin在胃消化阶段并未消化,在肠消化前10 min内快速消化。β-LG-rutin在胃肠道消化后粒径更小,胃肠道消化同时也改变了Trp的微环境,消化后组分亲水性增加。β-LG-rutin与β-LG消化后致敏性都大幅降低。分子量变化说明β-LG-rutin模拟消化后酶解的更彻底。(3)采用碱法制备芦丁与乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)共价复合物,并通过多光谱探究了其结构变化,通过热稳定性、抗氧化性、乳化性等探究了WPI的功能特性变化。自由基团含量和质谱证明β-LG以及α-LA都与芦丁形成共价复合物。圆二色和红外光谱证明芦丁的共价结合使得WPI二级结构发生了改变。芦丁的共价结合能够提高WPI的热稳定性,WPI-R(乳清分离蛋白-芦丁共价复合物)由于其具有更高的zeta电势,静电斥力的增加,有利于胶束的形成,使得能够有效提高WPI的乳化能力。疏水性的降低和自由巯基的减少的同时,油脂能够吸附的乳清蛋白含量减少,从而形成的蛋白质膜更加疏松,这也是WPI-R乳液稳定性降低的主要原因。在芦丁的共价修饰后,WPI-R表现出了更高的DPPH和ABTS自由基清除率,分别为34.86%和85.65%。以上的研究结果表明,芦丁的共价修饰不仅能够有效降低β-LG的致敏性,且能够提高其抗氧化性和消化特性,提高WPI热稳定性也能够为乳清蛋白的储存问题提供了理论和实践基础,同时扩大了食源性多酚芦丁的应用面,也为乳清蛋白的功能改善提供了理论和应用基础。
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