第一部分中国汉族人群遗传性共济失调基因诊断平台的建立第一章常染色体显性遗传和散发脊髓小脑型共济失调基因诊断平台的建立研究发现不同的种族、国家和地区,常染色体显性遗传脊髓小脑型共济失调(Spinocerebellar ataxia,SCA)不同亚型的发病率及各亚型病理和正常的核苷酸重复次数都有明显的差异,为了建立SCA致病基因的诊断平台,了解中国汉族人群SCA各亚型的分布频率特点及中国汉族人群各亚型病理和正常重复次数范围分布特点,制定一套SCA基因诊断流程,我们应用聚合酶链反应、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern Blot等技术对来自中国汉族人群667例临床诊断为SCA的患者(430例AD遗传家系先证者,237例散发患者)进行了SCA1、SCA2、SCA3/MJD、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17及DRPLA各亚型致病基因多核苷酸重复突变检测；对排除以上SCA亚型的患者应用聚合酶链反应(PCR)、变性高效液相色谱(DHPLC)、多重连接探针扩增(MLPA)结合直接测序等技术进行SCA11、SCA13、SCA14、SCA27、SCA28和SCA31亚型致病基因TTBK2、KCNC3、PRKCG、FGF14、AFG3L2和PLEKHG4点突变和SCA5、SCA11、SCA15致病基因SPTBN2、TTBK2、ITPR1大片段的插入缺失突变检测。应用T载体克隆重组DNA技术结合直接测序,对部分患者进行CAG三核苷酸病理重复次数测序分析；并应用荧光聚合酶链反应、毛细管凝胶电泳对300名中国汉族健康对照人群进行了上述SCA型三核苷酸或多核苷酸重复次数的正常范围检测和分析。结果在430例AD-SCA家系先证者中,共检测出SCA1家系25个(5.81%), SCA2家系27个(6.28%), SCA3家系267个(62.09%), SCA6家系8个(1.86%), SCA7家系8个(1.86%),SCA12家系1个(0.23%)和SCA17家系1个(0.23%),未明确基因分型SCA家系93个(21.63%)；在237例散发患者中共检测出SCA1患者6例(2.53%), SCA2患者9例(3.80%), SCA3患者23例(9.70%), SCA6患者3例(1.27%),未明确分型SCA患者196例(82.70%)；未检测出SCA8、SCA10和DRPLA亚型致病基因多核苷酸异常重复突变,SCA5、SCA11、SCA13、SCA14、SCA15/ SCA16、SCA27、SCA28和SCA31亚型传统形式的点突变及大片段的插入缺失突变。对23例SCA1患者,32例SCA2患者,305例SCA3/MJD患者,9例SCA6患者,27例SCA7患者,3例SCA12患者和2例SCA17患者进行CAG三核苷酸异常重复次数范围检测发现其范围分别是SCA1亚型39-60(平均51.09±4.88)次,SCA2型36-51(平均40.34±4.40)次,SCA3/MJD亚型49-86(,平均73.84±5.07)次,SCA6亚型23-29(平均25.56±1.94)次, SCA7亚型38-71(平均58.22±10.90)次,SCA12亚型51-52(平均51.33±0.58)次,SCA17亚型53-55(平均54.00±1.41)次；SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17和DRPLA共10种SCA亚型致病基因正常三核苷酸或多核苷重复次数范围结果,SCA1亚型为17～35次,SCA2亚型为14～28次,SCA3/MJD亚型为13～41次,SCA6亚型为4～16次,SCA7亚型为5～17次,SCA12亚型为5～21次,SCA17亚型为23～41次,DRPLA亚型为12～33次,SCA8亚型中CTA/CTG三核苷酸的重复次数为12-43次,SCA10亚型中ATTCT五核苷酸的重复次数为9～32次。根据以上结果我们发现在中国汉族人群中SCA3/MJD为最常见的SCA亚型,其次为SCA2、SCA1、SCA7和SCA6, SCA12和SCA17比较少见,SCA8、SCA10和DRPLA罕见,其中SCA17亚型为国内首次报道。建立中国汉族人群不同SCA亚型CAG三核苷酸病理重复次数范围标准和中国汉族人群不同SCA亚型正常核苷酸重复次数范围,可为SCA的诊断提供参考标准。初步建立了SCA基因诊断平台,制定了SCA基因诊断流程。第二章常染色体隐性共济失调基因诊断平台的建立常染色体隐性遗传小脑性共济失调(autosomal recessive cerebellar ataxia, ARCA)是一大类比较罕见的、具有明显临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病,为了建立中国汉族人群ARCA致病基因的诊断平台,了解中国汉族人群ARCA各亚型的分布频率,制定一套ARCA基因诊断流程,我们采用PCR结合DNA直接测序法对来自中国汉族人群36例临床诊断为常染色体隐性遗传先证者和60例发病年龄<20岁的散发SCA患者进行了发病率相对较高的弗里德赖希共济失调(FRDA),伴选择性维生素E缺乏的共济失调(AVED),伴动眼不能的共济失调1型(AOA1),伴动眼不能的共济失调2(AOA2)型等共四种亚型进行致病基因FXN、ATTP、APTX和SETX的相关检测分析。常规PCR难以对基因比较大外显子比较多的ARCA亚型完成突变检测,如毛细管扩张共济失调(AT),痉挛性共济失调(SACS),我们利用全基因外显子组捕获结合高通量测序技术(Exome测序)对其进行全基因外显子组测序分析。结果未发现FXN、ATTP、APTX和SETX基因致病突变,全基因外显子组测序发现一个AT患者ATM基因(c.5293 C-T)和(c.1402-1403delAA)复合杂合突变；一个SACS家系SACS基因(c.5399 G-C)和(C.788delA)复合杂合突变。S anger测序证实了该复合杂合突变的正确性,并且两个复合杂合突变在AT家系和SACS家系内分别和疾病表型共分离。本研究证实中国汉族人群ARCA家系中FRDA、AVED、AOA1和AOA2非常罕见,初步建立了ARCA基因诊断平台,制定了ARCA的基因诊断流程,以及应用Exome测序进行ARCA基因诊断的技术平台。第二部分一个常染色体显性遗传SCA家系致病基因的定位与克隆第一章一个新的常染色体显性遗传SCA家系致病基因的定位遗传性脊髓小脑型共济失调(spinocerebellar ataxia, SCA)是一类包括多种亚型在内的具有明显临床和遗传异质性的进行性神经系统退行性疾病,目前已经定位了近28个基因位点,其中22种SCA亚型致病基因已被克隆。前期工作我们收集到一个来自中国汉族的SCA家系,呈四代遗传,患者表现缓慢进展的晚发型小脑性共济失调,部分患者伴有明显的痉挛性斜颈。前期工作已经排除了已知的SCA1、SCA2、SCA3/MJD、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17和DRPLA亚型致病基因三核苷酸及多核苷酸异常重复突变检测,SCA11、SCA13、SCA14、SCA27、SCA28和SCA31亚型致病基因TTBK2、KCNC3、PRKCG、FGF14、AFG3L2和PLEKHG4点突变,SCA5、SCA11、SCA15致病基因SPTBN2、TTBK2、ITPR1大片段的插入缺失突变检测和目前已定位各SCA亚型位点的连锁分析排除定位检测。通过采用HumanLinkage-12 Panels连锁分析芯片技术,对该AD-SCA家系SNP位点进行扫描,结果在第20号染色体的两个SNP rs12624577和rs674630之间,相当于20p13-12.2的区域,取得连续分布正LOD值。其中,在rs976192取得最大两点LOD值3.85,对上面区间应用微卫星遗传标记进行精细定位分析,在20号染色体上微卫星遗传标记D20S437处取得最大两点LOD值5.36,依据这两个重要的重组交换事件的发生,该家系的候选致病基因定位于D20S199和D20S917之间的区域,家系内所有临床诊断明确的患者均携带相同的单体型。该定位区间(20p13-12.2)遗传距离为18.45 cM,相当于物理距离约有8.4 Mb,区间内包含有91个候选致病基因。第二章应用Exome测序克隆一新的常染色体显性遗传脊髓小脑型共济失调致病基因-TGM6单基因病致病基因的克隆常采用传统的候选基因定位克隆技术,然而传统的定位克隆技术常常会因为家系内成员太少、基因位点的异质性、外显不全及定位区间内候选克隆基因太多等而受到限制。全基因外显子组捕获结合高通量测序一次可获得全部外显子的信息,从根本上解决了传统克隆致病基因的难题。我们联合应用连锁分析结果和Exome测序的方法去克隆一新的SCA致病基因。首先从一个呈四代遗传的SCA家系(CS)中选取4位患者进行了Exome测序,经数据分析在TGM6基因10号外显子上面发现一个错义突变c.1550T-G(L517W),该突变在家系内和疾病表型共分离,并且在500个正常对照测序分析没有发现该突变位点。信息学分析发现该错义突变在进化过程中处于高度保守区域,功能预测该突变对蛋白质的功能有明显的影响。应用连锁分析的结果,TGM6基因c.1550T-G(L517W)改变正好位于之前该家系全基因组连锁分析定位的区间(20p13-12.2)内,Exome测序和全基因组连锁定位分析的结果互相验证了TGM6基因为该家系致病基因的正确性。我们又在另外一个SCA家系(LY)发现了TGM6基因7号外显子的另外一个位点c.980A-G transition(D327G)突变,该突变LY家系内同样和疾病表型共分离,在500个正常对照测序分析没有发现该位点突变。该新的突变进一步证实了我们克隆的新的致病基因的正确性。新的致病基因TGM6的克隆说明在单基因遗传疾病中在一个家系内对部分患者进行Exome测序从而寻找致病基因是一种有效的策略,如果利用Exome测序技术和传统的定位克隆研究方法相结合,可能成为进行人类单基因遗传疾病克隆的一个更高效的新途径。第三部分应用Exome测序克隆两个新的常染色体隐性遗传共济失调致病基因--JXX和TYY在遗传性共济失调中,常染色体隐性小脑性共济失调(Autosomal recessive cerebellar ataxias, ARCA)是一大组比较罕见的具有明显临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病,病变主要累及小脑、脊髓小脑束或/和脊髓感觉束。ARCA临床表型复杂可累及中枢神经系统、周围神经系统,部分病例可累及除神经系统之外的其它系统和器官。ARCA还包括一大批罕见的类型,根据分子发病机制、病理、自然病史和病变部位,目前ARCA中至少已划分了100多种不同的类型,其中70多个相关的致病基因已被克隆。多数的ARCA家系,因为家系成员少使得应用传统的候选基因定位克隆方法去克隆致病基因比较困难。我们应用Exome测序技术对两个ARCA家系(JX家系和TY家系)进行了全基因组外显子的捕获和测序分析,作为常染色体隐性遗传模式,我们在测序结果里主要分析纯和突变和复合杂合突变。结果我们在JX家系内发现了一个JXX基因(c.493C-T)的纯和突变,在TY家系内发现TYY基因(c.568C-T)和(c.760A-G)两突变位点的复合杂合突变,信息分析发现JXX基因(c.493C-T)和TYY基因(c.568C-T)与(c.760A-G)三个突变位点均位于高度保守区域,并且分别在JX家系和TY家系内与疾病表型共分离。500个正常对照测序分析没有发现以上三个突变位点的改变,排除了罕见多态的可能。我们又在另外一个ARCA家系(JX-NX)发现了JXX基因另外两个位点(c.389A-T和c.441G-T)的复合杂合突变,该复合杂合突变在JX-NX家系内和疾病表型共分离,在500个正常对照测序分析没有发现该两个突变位点。该新的复合杂合突变进一步证实了我们克隆的新的致病基因的正确性。新的ARCA致病基因JXX和TYY的克隆证实了在一些少见的孟德尔单基因疾病致病基因的克隆中全基因外显子组测序是一个方面而又高效的策略。