昆虫病原线虫(Entomopathogenicnematodes,EPN)指以昆虫为寄主的致病性线虫,其致病性源自于其肠道内所携带的共生菌,二者呈互惠共生关系。目前已发现的昆虫病原线虫有3大类,分别是小杆科(Rhabditidae)拟异小杆属(Heterorhabditidoides)、异小杆科(Heterorhabditidae)和斯氏线虫科(Steinernematidae)。本研究试材崇明拟异小杆(Heterorhabditidoides chongmingensis)线虫为本实验室在上海崇明岛分离到的EPN新种,其与嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)共生。前期研究运用Solexa高通量测序技术对崇明拟异小杆线虫的模式品系DZ0503CMFT(DZ)与其自身共生菌DZ0503SBS1T(S1)和非自身共生菌DR186(186)构建形成的单菌线虫组合DZ-S1和DZ-186的小RNA文库进行测序,两文库中新型miRNA的表达量具有显著差异。本研究选取显著上调的n-miR-10和n-miR-9进行研究,获得以下主要研究结果:扩增差异表达的n-miR-9和n-miR-10含前体序列在内的片段,序列长度分别为293 bp与330 bp。利用分子生物学技术将n-miR-9与n-miR-10的前体与过表达载体重组。构建好的过表达载体以饲喂法转入DZ-S1线虫中,培养3天后提取总RNA并反转成cDNA,采用荧光定量的方法检测候选靶基因表达量变化。结果表明,n-miR-9候选靶基因的表达量差异明显,呈现上调。n-miR-10候选靶基因均有显著性下调。为了进一步鉴定n-miR-9与n-miR-10的靶基因,以DZ-S1线虫的cDNA为模板扩增靶基因。分别扩增出n-miR-9候选靶基因DZMN9-3和n-miR-10的候选靶基因DZMN10-1、DZMN10-3和DZMN10-5,并构建相应的靶基因过表达载体。含有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的靶基因过表达载体与miRNA过表达载体共转染DZ线虫,利用荧光显微镜检测DZ线虫体内绿色荧光变化。结果显示:DZMN9-3对照组在培养3天后DZ体内绿色荧光并无明显差异,而实验组在培养三天后DZ体内绿色荧光有一定程度的减弱,结合荧光定量的结果:我们推测n-miR-9还存在着其他的靶位点,能调控启动子等转录元件来提高基因的表达;n-miR-10靶基因DZMN10-1的实验组DZ线虫体内荧光有明显降低与荧光定量结果相符合,靶基因DZMN10-3与DZMN10-5实验组均无明显变化。将过表达载体pPD95.67::DZMN9-3与pPD95.67::DZMN10-1通过饲喂法转入DZ线虫中发现,DZMN9-3对DZ线虫的发育率具有一定的抑制作用,与n-miR-9对DZ发育率影响结果相一致;DZMN10-1对DZ线虫的体长起抑制作用。