论文部分内容阅读
目的:急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是多能干细胞发生突变所形成的一类造血系统的恶性克隆性疾病。随着分子生物学技术不断地应用于临床,越来越多的基因突变检测在白血病诊断、治疗监测和预后评估中得到应用并发挥重要的作用。在急性髓系白血病中,核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)编码基因是突变率最高的基因之一,其突变状态对白血病患者的生存和预后均有重要影响。因此,对NPM1基因突变的检测显得尤为重要。本课题旨在建立检测NPM1基因突变的等位基因特异性PCR方法,为临床检测急性髓系白血病病人NPM1基因突变提供灵敏、高效而又简便的方法,从而为临床进行急性髓系白血病的治疗效果监测和预后评估提供实验依据。 方法:⑴分别设计并合成5对引物,以健康人淋巴细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到野生型NPM1基因片段和A、B、C、D四种突变型的NPM1基因片段,并分别克隆至载体pEGFP-C1中,作为后续检测的标准品。⑵AS-PCR方法的建立。根据等位基因特异性PCR方法(AS-PCR)的原理,设计一对特异引物,以四种突变型的pEGFP-C1-NPM1重组质粒为模板,优化反应体系和反应条件。摸索出该方法检测的最低检测下限,并验证该方法的可行性。⑶利用AS-PCR方法检测急性白血病患者NPM1基因突变情况,并分析基因突变与FAB分型、遗传学异常以及预后的相关性。 结果:①构建了野生型pEGFP-C1--NPM1(wild)和A、B、C、D四种突变型的pEGFP-C1-NPM1五种重组质粒,经PCR扩增和测序鉴定与预期结果一致,证明质粒构建成功。②建立了可以同时检测NPM1基因A、B、C、D四种突变体的AS-PCR方法,该方法的检测上限为109 copies/ml,检测下限为103copies/ml,野生型NPM1基因在103 copies/ml-109 copies/ml间对该方法无干扰。③对临床231例初诊白血病患者标本进行检测,其中62例患者标本有NPM1基因突变,阳性率为26.8%(62/231)。其中,M1占33.3%(3/9);M2占38.9%(28/72); M3占14%(7/50);M4占15%(3/20);M5占41.7%(10/24);M6占25.0%(1/4);ALL占25.0%(6/24);CLL占33.3%(2/6); CML占11.1%(1/9)和特发性血小板减少性紫癜占100%(1/1)。 结论:⑴成功构建了野生型pEGFP-C1--NPM1(wild)和A、B、C、D四种突变型的pEGFP-C1--NPM1五种重组质粒。⑵建立一种可以同时检测A、B、C、D四种高频突变的AS-PCR方法,能够给临床检测NPM1基因突变提供一种新型的检测方法。⑶在AML患者中NPM1突变有明显差异,其中M5和M2患者较为多见。