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[背景目的]卡介革(Bacillus Calmette-Guerin,BBG)尽管是当前全球使用最广泛、预防婴幼儿重症结核病(tuberculosis,TB)最有效的疫苗,但保护青少年和成人罹患肺结核的能力明显不足。目前,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)和HIV共感染的发病率持续上升,耐多药结核病(multidrug resistant tuberculosis,MDR-TB)病例不断出现,TB的防控形势仍非常严峻。发展更有效的TB疫苗成为当务之急。亚单位疫苗是TB新一代疫苗的重要类型之一,具有安全和稳定等优点。然而,缺乏适合的、获得批准可用于临床的佐剂,显著阻碍了 TB亚单位疫苗的发展。MTO是由单磷酸脂质A(MPL),海藻糖6.6’—二十二烷酸酯(TDB)和MF59组成的佐剂,被用于辅佐新型TB候选疫苗能有效刺激Th1型T细胞反应,但其诱导的IL-2阳性多功能T细胞不足,致使疫苗产生的抗M.tb感染保护力较为有限。加热灭活的牡牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae,Mv),可诱导细胞毒性CD8+T和CD4+T细胞反应,有较强的佐剂活性。本研究拟将Mv与MTO联合,构建一种新的佐剂MTOM。然后,将 Mv、MTO 和 MTOM 分别与TB融合蛋白Rv3407-PhoY2-Ag85A-Rv2626c-RpfB(WH121)混合制成亚单位疫苗,利用小鼠TB感染模型,观察并比较三种亚单位疫苗的免疫保护效应及其作用机制。[方法]1.融合蛋白WH121的制备和定量。2.佐剂和疫苗的制备:分别制备Mv、MTO和MTOM佐剂;并分别与WH121联合制成亚单位疫苗。3.C57BL/6小鼠分组和免疫:分为WH121组、Mv组、MTO组、MTOM组、WH121/Mv组、WH121/MTO组和WH121/MTOM组,分别用相应的蛋白、佐剂和亚单位疫苗皮下注射进行免疫,共2次,每次200μL,间隔3周。PBS为阴性对照、BCG为阳性对照,分别用200 μL的PBS和BCG(1 × 106CFU)于实验0周时皮下注射1次。4.抗M.tb感染的保护性评价:末次免疫6周后,M.tb H37Rv(100CFU)经滴鼻方式感染各组免疫小鼠,4周后处死动物,进行肺脏和脾脏菌落计数,制作肺组织切片、进行HE和抗酸染色,观察脏器荷菌量和肺切片病理学改变。5.末次免疫6周后,比较各免疫组的免疫原性:1)分离血清,ELISA法分析小鼠血清中特异性IgG抗体及其亚类IgG1和IgG2c的水平。2)制备小鼠脾细胞,ELISA法检测小鼠脾细胞分泌PPD和WH121特异性的 IFN-γ、TNF-α 和 IL-2 水平。3)采用流式细胞术和胞内细胞因子染色检测小鼠脾细胞PPD和WH121特异性IFN-γ、TNF-α和IL-2多功能CD4+和CD8+T细胞数量。[结果]1.与PBS组比较,各免疫组肺脏、脾脏细菌荷载量和肺脏病理损伤均有不同程度的改善。相较于WH121/MTO和WH121/Mv组,WH121/MTOM组小鼠的脏器荷菌量明显降低(p<0.05或p<0.001);小鼠肺脏病理损伤显著减轻、抗酸杆菌明显减少,提供了与BCG相当的抗TB保护作用。2.与BCG比较,WH121/MTOM诱导小鼠产生的WH121特异性IgG、IgG1、IgG2a水平明显升高(P<0.001);IgG2a/IgG1比值明显上升,显著促进了IgG亚类向Th1型反应转换。相较于WH121/MTO和WH121/Mv,WH121/MTOM诱导的抗体水平和IgG亚类向Th 1型反应转换的趋势更明显(P<0.05)。3.与BCG比较,WH121/MTOM诱导小鼠产生了较高水平的WH121特异性TNF-α 和 IL-2(P<0.001);与 WH121/MTO和 WH121/Mv 比较,WH121/MTOM诱导的WH121特异性IFN-丫、TNF-α和IL-2均明显增加(P<0.05 或P<0.001)。4.与MTO和Mv单独佐剂比较,佐剂MTOM诱导的IL-2~+单阳、双阳和三阳性多功能CD4+、CD8+T细胞数量明显增多(P<0.05)。5.与MTOM组比较,WH121/MTOM组三种细胞因子所有组合方式的WH121特异性CD4+T细胞均明显增加(P<0.05);与BCG比较,WH121/MTOM亚单位疫苗诱导了较高水平的PPD和WH121特异性的IFN-γ+IL-2~+双阳性CD4+T细胞(P<0.05)。6.与 MTOM 组比较,WH121/MTOM 组除了 IFN-γ+TNF-α+ 双阳性 CD8+T 细胞外,细胞因子其它六种组合的WH121特异性CD8+T细胞数量均明显增加(P<0.05);与BCG组比较,WH121/MTOM组所有WH121特异性的IL-2~+单阳、双阳和三阳性的CD8+T细胞均显著升高(P<0.05)。[结论]1.MTO和Mv混合组成的新型佐剂MTOM,具有增强Th1型反应和增加IL-2~+多功能T细胞的能力,可用于研制抗胞内病原体感染的候选疫苗。2.本研究为WH121/MTOM疫苗在其它动物模型中进行进一步的临床前评估奠定了实验基础,有助于加快TB疫苗的研究和发展。