论文部分内容阅读
目的：本研究通过建立条件性敲除大脑皮层兴奋性神经元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因小鼠[Notch1, Notch2, and Notch1/2 conditional knockout (cKO) mice],旨在探讨Notch1和/或Notch2是否为早老素/γ分泌酶介导成年中枢神经系统中神经元存活的功能靶底物,及Notch1、Notch2基因与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)相关性的分子生物学机制。方法：我们使用了与条件性敲除早老素或Nicastrin基因小鼠模型相同的技术,如基因载体的构建,胚胎干细胞的获得,同源重组,选择筛选已击中的细胞,与aCaMKⅡ-Cre转基因小鼠杂交等方法,获得条件性敲除大脑皮层兴奋性神经元中Notch1、Notch2及Notch1/2基因小鼠[Notch1, Notch2, and Notch1/2 conditional knockout (cKO) mice],并使用PCR及Western blot方法检测Notch1/Notch2等位基因及其蛋白表达评价此三种基因敲除小鼠是否成功；运用尼氏染色、免疫组织化学及Western blot技术分析该模型小鼠大脑皮层形态、体积、神经元数量、胶质细胞增生等变化；运用Northern blot和Western blot技术分析Notchl及Notch2的mRNAs及蛋白表达水平的变化。结果：本研究建立的小鼠模型中,成功的在大脑皮层兴奋性神经元中发生了条件性敲除,且当原代培养的floxed Notchl/Notch2新生小鼠大脑皮层神经元中引入Cre重组酶后,Notchl及Notch2本来的高表达在3-4天后也完全消失,证明了Cre重组酶系统的有效性。我们并未在成年Notch cKO小鼠模型(年龄约2岁)的大脑皮层中检测到任何神经退行性变化。在成年Notch1, Notch2 cKO小鼠模型(年龄约2-3月)的大脑皮层中也未检测到Notch1及Notch2的mRNAs及蛋白质水平的减退。结论：以上实验结果说明Notch1及Notch2并不是早老素或Y分泌酶介导的神经元存活的直接底物,并且Notch1及Notch2受体蛋白并不或很少在成年小鼠大脑皮层兴奋性神经元中表达,未来的研究将集中在Notch受体蛋白在除外兴奋性神经元的大脑其它细胞中的功能与AD发生发展的关系,及其它可能参与调节早老素/γ分泌酶影响神经元存活的重要底物。