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目的:以大鼠多巴胺能神经元细胞系(简称“N27”细胞)构建慢病毒细胞稳转株,探讨mi RNA-nov-1/Dhrs3在锰致N27细胞凋亡中的调控机制,以及m TOR信号通路关键分子变化的特点,进一步阐明锰致神经毒性的分子机制。方法:1.N27细胞分为以下2组:Mn Cl20μmol/L(空白对照组,Control组)、300μmol/L(模型组,Model组)24h。CCK8检测细胞活力,Western blot检测Dhrs3、凋亡相关蛋白(Caspase-3、Cleaved-caspase-3)和m TOR信号通路相关蛋白(m TOR、p-m TOR、p-S6K1、S6K1、p-4E-BP1、4E-BP1、p-Akt、Akt)的表达;RT-q PCR检测mi RNA-nov-1、Dhrs3 m RNA的表达;核酸序列比对软件预测mi RNA-nov-1与Dhrs3的结合位点。2.将N27细胞分为以下7组:空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、锰+慢病毒空载组(NC组)、锰+mi RNA-nov-1过表达组(mi RNA-nov-1 up组)、锰+mi RNA-nov-1低表达组(mi RNA-nov-1 sponge组)、锰+沉默Dhrs3组(sh-Dhrs3组)、锰+mi RNA-nov-1低表达+Dhrs3沉默组(mi RNA-nov-1sponge+sh-Dhrs3组)。各组染锰剂量均为最佳染锰浓度(300μmol/L),染毒时间24h。用倒置显微镜观察各组的细胞形态;流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin V/PI双染色法);Hoechst 33324荧光染色法检测细胞凋亡率;Western blot检测Dhrs3、Caspase-3和m TOR信号通路相关蛋白(m TOR、p-m TOR、p-S6K1、S6K1、p-4E-BP1、4E-BP1、p-Akt、Akt)的表达;RT-q PCR检测mi RNA-nov-1、m TOR、S6K1、4E-BP1、Akt m RNA的表达。结果:1.CCK8实验发现,锰对N27细胞活性的影响呈剂量效应关系,细胞的活性随剂量的增加而下降。Western blot结果显示,与Control组相比,Model组Dhrs3表达下降(P<0.05),凋亡相关蛋白(Caspase-3、Cleaved-caspase-3)和m TOR信号通路磷酸化蛋白(p-m TOR、p-S6K1、p-4E-BP1、p-Akt)的表达增加(P<0.05),总蛋白(m TOR、S6K1、4E-BP1、Akt)的表达不变(P>0.05)。RT-q PCR结果显示,与Control组相比,Model组的mi RNA-nov-1表达上调,Dhrs3表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。核酸序列比对软件预测mi RNA-nov-1与Dhrs3存在结合位点。2.Western blot结果显示,与Model组和NC组相比,mi RNA-nov-1 up组和sh-Dhrs3组的Caspase-3、p-m TOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达增加(P<0.05);mi RNA-nov-1 sponge组的Caspase-3以及p-m TOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达降低(P<0.05);mi RNA-nov-1 sponge+sh-Dhrs3组的Caspase-3以及p-m TOR、p-Akt、p-S6K1、p-4E-BP1表达量无明显差异(P>0.05)。与Model组和NC组相比,mi RNA-nov-1 up组和sh-Dhrs3组的Dhrs3表达下降(P<0.05);mi RNA-nov-1 sponge+sh-Dhrs3组的Dhrs3表达量无明显差异(P>0.05)。RT-q PCR结果显示,与Control组相比,其它6组mi RNA-nov-1的表达量均增加(P<0.05),与Model组和NC组比较,mi RNA-nov-1 up组和sh-Dhrs3组mi RNA-nov-1的表达量增加(P<0.05),mi RNA-nov-1 sponge+sh-Dhrs3组mi RNA-nov-1表达无显著差异(P>0.05)。与Control组相比,Model、NC、mi RNA-nov-1 sponge、sh-Dhrs3、mi RNA-nov-1 sponge+sh-Dhrs3组的m TOR、Akt、S6K1 m RNA表达无显著差异(P>0.05)。Annexin V/PI双染流式细胞术检测结果显示,与Control组比较,其它6组的凋亡率明显升高(P<0.05),与Model组和NC组相比,mi RNA-nov-1 up组和sh-Dhrs3组N27细胞的凋亡率明显升高(P<0.05);mi RNA-nov-1 sponge组细胞的凋亡率明显下降(P<0.05);mi RNA-nov-1 sponge+sh-Dhrs3组的凋亡率无显著差异(P>0.05)。Hoechst 33324荧光染色法检测结果显示,与Control组比较,其它6组细胞核呈致密浓染的凋亡细胞明显增多,与Model组和NC组相比,mi RNA-nov-1 up组和sh-Dhrs3组N27细胞的凋亡率明显升高;mi RNA-nov-1sponge组细胞的凋亡率明显下降;mi RNA-nov-1 sponge+sh-Dhrs3组的凋亡率无显著性变化。结论:1.锰致N27细胞凋亡中mi RNA-nov-1表达上调,Dhrs3表达下调;2.mi RNA-nov-1可能通过负向调节Dhrs3激活m TOR信号通路促进锰诱导的N27细胞凋亡。