论文部分内容阅读
近年来,全球范围内糖尿病及糖尿病前期患者数量迅速增加。作为一种慢性基础性代谢疾病,糖尿病对居民健康的威胁日益严重却缺乏有效的治疗手段,因此通过膳食摄入实现血糖干预的需求愈发迫切。苦荞是一种被广泛认为具有降血糖活性的膳食资源,对苦荞中降糖成分的探究经历了总黄酮、芦丁、槲皮素、D-手性肌醇等不同阶段。最新研究表明,苦荞制品加工过程中以芦丁为初始原料转化而成的乙基芸香苷（Ethyl-rutinoside,ER）,可能是起到血糖调控作用的重要活性成分。但截至目前,对于加工中ER形成的过程,调控机制,最终食品中降血糖的有效性等方面仍缺乏系统研究。针对上述问题,本研究基于UPLC-MS/MS检测手段,筛选出具备高ER转化潜力的苦荞原料,评估了ER的降血糖作用效果并推测了其潜在的作用机制;基于优化的酶促条件,建立了超微粉碎联合酶催化处理工艺以提高原料加工过程中ER的得率,最终将其应用于馒头生产,以验证高ER含量苦荞馒头的降血糖功效。具体研究内容及结果如下:（1）筛选高ER生成潜力的苦荞原料。采用UPLC-MS/MS检测了苦荞不同部位（花、叶、茎、根、壳、麸皮、皮粉和心粉）在酶促反应下ER转化的情况。其中,苦荞麸皮相比其他部位具备最高的ER转化潜力,经酶催化后ER含量在所有部位中最丰富,达到20.59 mg/g,对比催化前含量提升了66.67倍。麸皮属于苦荞种子部位,为收获具备最高ER生成潜力的麸皮,考察了苦荞种子不同成熟时段转化ER的能力。相比其他成熟时期,苦荞开花后21天的种子经催化后能够产生最高含量的ER（18.82 mg/g）。（2）明确了ER是苦荞中的重要降血糖功能成分。首先构建了Hep G2胰岛素抵抗模型,经过ER干预,葡萄糖消耗量最高可达到模型组的1.34倍,显著高于芦丁和槲皮素等黄酮成分（p＜0.05）。其次,经过ER处理后的胰岛素抵抗细胞,两种糖异生关键限速酶:葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶的活性仅为模型组的37.79%和75.69%,FOXO1基因表达量对比模型组下调了47.39%;在糖原合成方面,ER促使胰岛素抵抗细胞糖原合成量增加57.12%,同时显著下调GSK-3β基因的表达（p＜0.05）。以上说明ER能够通过抑制糖异生作用和促进糖原合成改善肝糖代谢。（3）酶催化过程ER转化条件及规律研究。首先通过硫酸铵沉淀,凝胶层析和阴离子层析法纯化出产生ER的苦荞内源转苷酶（Tartary buckwheat endogenous glucosyltransferase,TBEG）。在模拟TBEG催化的体系中,系统考察了p H值、反应温度、乙醇浓度、底物添加比例、金属离子、不同类型化学试剂等多种因素对ER产生的影响。结果表明:TBEG在p H=5、温度40℃、乙醇浓度为20%的条件下具有最高的催化活性,最适于ER的产生。当底物/酶（w/w）添加比例小于6时,TBEG能保持较高催化产生ER的效率。而金属离子(Zn2+、Al3+和Cu2+)和化学试剂（Tween 20、SDS和DMSO）的存在不利于ER的产生。其次,TBEG对黄酮苷底物识别规律表明,该酶适于催化键连3-O芸香苷配基（3-O-Rut Fla）类型的黄酮苷产生ER,对于芦丁和山奈酚-芸香苷为代表的黄酮醇类物质展示了较高的催化效率常数(Vmax/Km)。利用高分辨质谱在苦荞原料中共鉴定到13种3-O-Rut Fla类型黄酮苷。通过外源添加TBEG,成功催化了本不具备TBEG活性的苦荞原料产生ER。（4）超微粉碎联合酶催化处理提升ER的得率。使用前文筛选出高ER转化潜力的苦荞麸皮为原料,通过超微粉碎技术制备出不同粒径的苦荞麸皮微粉。结合前文模拟体系下优化的酶促反应条件（p H=5、温度40℃、乙醇浓度为20%）,针对不同粒径的苦荞麸皮微粉进行催化,结果表明平均粒径为42μm的苦荞麸皮微粉展现了高效转化ER的能力,ER得率由30%（未经研磨处理的苦荞麸皮原粉）提升至82%,同时DPPH、ABTS、FRAP和α-葡萄糖苷酶抑制活性也有所增加。根据上述结论,选取平均粒径为42μm的苦荞麸皮微粉,通过酶转化、干燥等工艺制备出高ER含量的苦荞麸皮微粉产品。该产品中ER含量由未经处理麸皮的0.31 mg/g提升至28.34 mg/g。（5）制备ER强化的苦荞降血糖馒头。使用上述经超微粉碎联合酶催化工艺制备的苦荞麸皮微粉为配料,开发出富含ER的苦荞麸皮微粉馒头（Tartary buckwheat micronized bran steam bread,TMBB）,其中ER含量为7.80 mg/g。体内降血糖实验中,TMBB的干预改善了二型糖尿病小鼠体重、饮水量、摄食量和排尿量等指标。相比于其他不含ER的苦荞馒头,TMBB对二型糖尿病小鼠降血糖效果最好:经过四周喂食后,小鼠血糖值相较造模组下降了48.52%,同时糖化血清蛋白与糖耐量对比造模组分别降低了40.69%和36.77%。TMBB的干预也能显著改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗相关指标（p＜0.05）。在脂代谢并发症方面,TMBB饮食可显著下调糖尿病小鼠血清中甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平（分别为模型组的50.72%、37.11%和58.37%）,同时提高了血清高密度脂蛋白胆固醇含量（为模型组的2.32倍）。根据肝脏和胰岛组织切片结果,四周TMBB添食能够有效修复二型糖尿病引起的小鼠肝脏和胰腺损伤。以上验证了高ER含量苦荞产品的降血糖功效。综上所述,本文系统地对ER开展研究,明确了该化合物是苦荞重要降血糖功能成分,阐明了其转化规律,并且在苦荞加工场景实现了含量的提升,最终开发了降血糖功效馒头,为苦荞降血糖产品加工领域提供了理论依据。