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第一部分抑制脐带血CD34+细胞体外扩增过程中P38 MAPK和mTORCl信号降低细胞衰老水平背景：造血干细胞移植(HSCT)是一种有效的治疗造血系统疾病的方法。但由于造血干细胞(HSCs)数量不足,严重阻碍了HSCT在临床中的应用。尽管临床上对脐带血HSCT的研究表明,脐带血HSCs在体外扩增两倍即可满足临床治疗的需求,但问题是传统利用组合细胞因子或饲养层细胞扩增HSCs的方法很难得到具有长期造血重建能力的HSCs。造血重建能力是衡量HSCs在植入受者体内后重建骨髓造血情况的指标。因此,在扩增HSCs的同时维持干细胞的自我更新、多谱系分化、相对静止等干细胞性质,即维持干细胞的干性(stemness)成为人们关注的焦点。HSCs的发育经历增殖、分化、衰老,最终走向死亡,因此可以通过调控HSCs的增殖、分化、衰老以及死亡过程从而达到促进其在体外扩增的目的。p-半乳糖苷酶是衰老细胞的一种生物学标志,其在细胞中活性增高意味着细胞衰老发生。衰老的HSC虽具有代谢活性,但丧失了干细胞的自我更新和多系分化潜能。我们之前的研究表明,抑制过度活化的P38 MAPK或mTORC1信号可以降低扩增后细胞内p-半乳糖苷酶的活性,通过抑制细胞衰老促进HSCs在体外扩增,并增强扩增后细胞的造血重建能力。鉴于抑制活化的P38 MAPK或mTORC1信号均可以抑制细胞衰老,我们期望同时抑制活化的P38 MAPK和mTORC1信号能进一步抑制细胞衰老,促进HSCs在体外扩增,同时增加HSCs的造血重建能力。方法：我们取健康产妇的脐带静脉血,利用磁珠分选的方法分离脐带血CD34+细胞。利用细胞因子IL-6、TPO、SCF和Flt3-Ligand扩增脐带血CD34+细胞,同时利用LY2228820和(或)Rapamycin抑制细胞体外扩增过程中活化的P38 MAPK和(或)mTORC1信号。在扩增后,我们利用western blot或流式细胞术检测细胞内P38 MAPK和mTORC1信号通路中重要的信号分子p-P38、p-P70 S6、p-4E BP1或p-mTOR的表达。利用流式细胞术检测扩增后细胞表面CD34、CD38、CD90、CD45RA分子的表达。同时利用流式细胞术检测了细胞增殖、周期、凋亡和衰老情况。另外,我们还通过克隆形成实验检测了扩增后的细胞形成克隆形成单位(CFU)的数量,其代表造血祖细胞的数量。结果：我们的结果显示脐带血CD34+细胞在体外扩增培养过程中P38 MAPK和mTORC1信号均被活化,LY2228820和Rapamycin可以有效抑制活化的P38 MAPK和nTORC1信号。与单独使用LY2228820或Rapamycin相比,同时使用LY2228820和Rapamycin增加了脐带血CD34+细胞在体外扩增后CD34+、CD34+、CD38-、 CD34+CD45RA-表型造血干/祖细胞在总细胞中的比例。但是,由于Rapamycin的使用导致总细胞扩增倍数减少,以至于联合使用LY2228820和Rapamycin并没有增加表型造血干/祖细胞的扩增倍数。另外,克隆形成实验的结果显示,与单独使用LY2228820或Rapamycin相比,联合使用LY2228820和Rapamycin没有增加CFU-E、CFU-GM、 CFU-M、CFU-GEMM和总的CFU数量,代表其并没有促进红细胞祖细胞、粒-巨噬细胞祖细胞、多潜能粒-红-巨噬-巨核细胞祖细胞以及总的祖细胞扩增或没有抑制造血祖细胞分化。我们分析Rapamycin导致总细胞扩增倍数减少的原因发现,Rapamycin抑制了细胞增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1期,但不影响细胞凋亡。对细胞衰老水平的检测发现单独使用LY2228820或Rapamycin均可以降低细胞内p-半乳糖苷酶的活性,提示其抑制细胞衰老：当同时使用LY2228820和Rapamycin时细胞内p-半乳糖苷酶的活性进一步降低,代表细胞衰老水平进一步降低。结论：抑制脐带血CD34+细胞体外扩增过程中活化的P38 MAPK和mTORCl信号通过抑制细胞衰老增加了扩增后表型造血干/祖细胞在总细胞中的比例。第二部分同时抑制细胞衰老和AHR信号促进脐带血造血干细胞扩增背景：我们前一部分的研究结果显示,脐带血来源的CD34+细胞在体外培养过程中P38 MAPK和mTORCl信号均被活化,共抑制活化的P38 MAPK和mTORCl信号通过降低细胞的衰老水平增加扩增后表型造血干/祖细胞在总细胞中的比例,但并没有促进表型造血干/祖细胞的扩增,我们分析其可能促进了HSC干性的维持。近年来研究发现,使用SR1抑制芳香烃受体(AHR)可以抑制HSCs在体外扩增培养过程中细胞的分化,促进HSCs在体外扩增。对敲除AhR基因的小鼠HSCs研究发现,虽然敲除AhR基因可以增加小鼠骨髓中表型造血干/祖细胞的数量,但同时也导致HSC丧失了自我更新能力。我们假设SR1抑制AHR信号促进HSCs扩增的同时也诱发了细胞衰老,那么在使用SR1抑制细胞分化的基础上同时抑制细胞衰老可能会进一步增加扩增后细胞的造血重建能力。本研究中我们期望通过调控细胞衰老和分化进一步促进HSCs扩增,增加扩增后细胞的造血重建能力。因此,我们在前一部分脐带血CD34+细胞培养基础上加入了抑制分化的小分子物质SR1,以期通过抑制细胞衰老和分化达到进一步促进HSCs在体外扩增和增加体内移植效率的目的。方法：按前一部分扩增脐带血CD34+细胞的方法扩增细胞,在前期抑制P38 MAPK和mTORCl的基础上加入SR1抑制AHR信号,同时设对照组、抑制P38 MAPK和mTORCl组和单独使用SR1组。扩增后,利用流式细胞术检测细胞内p-P38、p-mTOR和CYP1B1分子的表达；检测扩增后细胞表面CD34、CD38、CD90和CD45RA分子的表达：检测细胞增殖、凋亡和衰老情况。通过克隆形成实验检测扩增后CFU的形成。选择重度免疫缺陷NOD-Prkdcscid Il2rgnull小鼠作为移植受者,未扩增的或扩增后的细胞通过小鼠尾静脉移植入小鼠体内。在移植后第1、4、8周检测小鼠血液中人源性细胞嵌合率,在移植后第13周检测小鼠骨髓和脾脏中人源性细胞嵌合率,同时检测小鼠骨髓中人源性T、B淋巴细胞、髓细胞、红细胞、巨核细胞、NK细胞以及造血干／祖细胞占总的人源性细胞的比例。结果：我们的结果显示,使用LY2228820、Rapamycin和SR1可以分别抑制脐带血CD34+细胞体外培养过程中活化的P38 MAPK、mTORCl和AHR信号。与抑制P38MAPK和mTORCl信号或单独抑制AHR信号相比,共抑制活化的P38 MAPK、mTORCl和AHR信号明显增加了扩增后CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD90+、 CD34+CD45RA-细胞在总细胞中的比例,促进了代表造血干细胞和多潜能造血祖细胞的CD34+CD45RA-细胞扩增。克隆形成实验的结果显示,相对于抑制活化的P38 MAPK和mTORCl信号,共抑制活化的P38 MAPK、mTORCl和AHR信号或单独抑制AHR信号增加了CFU-GM、CFU-GEMM和总CFU的数量,提示我们共抑制活化的P38 MAPK、mTORCl和AHR信号或单独抑制AHR信号促进了造血祖细胞扩增或抑制了造血祖细胞的分化。我们对其机制的研究发现,共抑制活化的P38 MAPK、 mTORCl和AHR信号通过降低扩增后细胞的分化和衰老水平从而促进造血干／祖细胞扩增。体内实验的结果显示,与未扩增的细胞或对照组相比,抑制活化的P38 MAPK和mTORCl信号或单独抑制AHR信号增加扩增后细胞在小鼠血液和骨髓中的植入率：与抑制活化的P38 MAPK和mTORCl信号或单独抑制AHR信号相比,共抑制活化的P38 MAPK、mTORCl和AHR信号进一步增加了扩增后细胞在小鼠血液和骨髓中的植入率。移植的细胞均具有造血重建能力。结论：共抑制活化的P38 MAPK、mTORCl和AHR信号通过抑制脐带血CD34+细胞体外扩增过程中细胞分化和衰老,进而促进HSCs扩增,增加细胞在体内造血重建能力。