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目的:1.作为独立实验,运用分子生物学研究方法,通过探索黄芪、水蛭各有效组分及组分配伍对经脂多糖(LPS)诱导增殖的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)相关因子P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)、核转录因子-κB(NF-κB)、核转录生长因子κB抑制因子(IκBα)表达的影响,结合P38丝裂原激活蛋白激酶/核转录因子(-κB)(P38MAPK/NF-KB)信号通路,分析GMC增殖和细胞外基质(ECM)沉积的可能发生机理、比较益气化瘀中药黄芪、水蛭各组分及组分配伍的作用强度,从而探讨中药从益气化瘀层面保护肾脏的可能工作机制。发掘益气化瘀中药运用于临床治疗的可行性方案,为现代中医药治疗儿童MsPGN提供药理学依据。2.结合课题组前期实验成果和连续性实验方案,完善相关实验数据,为进一步寻找且证实指标与指标之间,指标与通路之间的相关性,提供通路的梳理思路,将看似“独立”的各实验指标串连成“线”,从而“由点及面”的进一步系统阐明疾病发生的相关机制和治疗机理。方法:体外培养大鼠GMC,采用CCK-8法检测黄芪、水蛭各有效组分及组分配伍对大鼠肾小球系膜细胞HBZY的最大无毒浓度。实验随机分为正常对照组、模型组、水蛭素组、黄芪多糖组、黄芪甲苷组、毛蕊异黄酮组、水蛭素&黄芪多糖组、水蛭素&黄芪甲苷组、水蛭素&毛蕊异黄酮组(注:&寓意和)。将各有效组分及组分配伍分别加入至经LPS刺激增殖12h后的HBZY细胞中进行干预24h,分别采用Westerm blotting法和细胞化学免疫荧光法检测大鼠肾小球细胞中P38MAPK、NF-κB、IκB蛋白的表达变化。结果:1.Western blotting法显示:模型组大鼠系膜细胞经LPS诱导增殖后P38MAPK、NF-κB蛋白表达量比正常组增多,两组相比(P<0.05),各实验组与模型组相比,除毛蕊异黄酮组、水蛭素&毛蕊异黄酮组蛋白量微弱降低外(P>0.05),其余各组P38MAPK、NF-κB的蛋白表达均有明显降低(P<0.05),表明黄芪、水蛭各有效组分及组分配伍能够不同程度的下调P38MAPK、NF-κB的蛋白表达。各用药组间蛋白量相比P>0.05,无明显统计学差异。2.Westerm blotting法显示:模型组大鼠系膜细胞经LPS诱导增殖后,IκB蛋白表达量比正常组显著降低,两组相比(P<0.05),除水蛭素&毛蕊异黄酮组微弱升高外(P<0.05),各实验组IκB蛋白量与模型组相比均有明显升高(P<0.05),各用药组间差异P>0.05,无统计学意义。表明黄芪水蛭各有效组分及组分配伍能够不同程度的抑制IκB的磷酸化,上调IκB蛋白的表达。3.细胞化学免疫荧光法显示:正常组核内少有绿色荧光表达,提示正常HBZY细胞核中NF-κB蛋白低表达;LPS组与之比较,绿色荧光强度高,提示LPS诱导HBZY细胞增殖,进而引起细胞核内NF-κB蛋白高表达;除水蛭素&黄芪甲苷组、水蛭素&毛蕊异黄酮组HBZY细胞核中绿色荧光强度较LPS组微弱降低外(P>0.05),其余各用药组绿色荧光强度明显降低,提示黄芪、水蛭各有效组分及组分配伍对P38MAPK蛋白的高表达有明显的下调作用(P<0.05)。各组别间比较:水蛭素组对细胞核内NF-κB蛋白高表达下调作用明显高于黄芪各有效成分组和黄芪、水蛭各组分配伍组(P<0.05),具有统计学差异,水蛭素的作用效果明显优于黄芪各有效成分组和成分配方组。4.细胞化学免疫荧光法显示:正常组绿色荧光表达强度低,提示正常HBZY细胞中P38MAPK蛋白有表达,但表达量低,与正常组比较,LPS组细胞绿色荧光强度高,提示LPS作用后引起HBZY细胞增殖,进而引起细胞内P38MAPK蛋白高表达,除水蛭素&黄芪甲苷组、水蛭素&黄芪多糖组微弱降低以外(P>0.05),水蛭素组、黄芪多糖组、黄芪甲苷组、毛瑞异黄酮组、水蛭素&毛蕊异黄酮组中绿色荧光强度较LPS组明显降低(P<0.05),提示益气化瘀药物对P38MAPK蛋白高表达有明显的下调作用,且具有统计学差异。黄芪各组分组与各组分配伍组两两比较P>0.05,说明黄芪各组分组和各组分配伍组对P38MAPK蛋白表达的下调作用无明显差异;与水蛭素组比较毛蕊异黄酮组、水蛭素&黄芪多糖组、水蛭素&黄芪甲苷组、水蛭素&毛蕊异黄酮组P38MAPK荧光表达P<0.05,说明水蛭素对P38MAPK蛋白表达的下调作用优于毛蕊异黄酮组及各组分配伍组。5.细胞化学免疫荧光法显示:正常组绿色荧光表达强度高,提示正常HBZY细胞中IκB蛋白高表达;LPS组细胞绿色荧光强度低,提示LPS作用后引起HBEH细胞增殖,进而引起细胞内IκB蛋白低表达;水蛭素组、黄芪多糖组、黄芪甲苷组、毛瑞异黄酮组、水蛭素&黄芪多糖组、水蛭素&黄芪甲苷组中绿色荧光强度较LPS组明显生高(P<0.01),提示以上药物对IκB蛋白低表达有明显的上调作用,具有统计学差异。水蛭素&毛蕊异黄酮组中的IκB蛋白与模型组相比,虽有升高但作用微弱(P>0.05),各组别间比较:水蛭素组对细胞内IκB蛋白低表达的上调作用明显高于黄芪各有效成分组和黄芪、水蛭各组分配伍组(P<0.05),具有统计学差异,水蛭素的调控效果明显优于黄芪各有效组分组和组分配伍组。结论:水蛭素、黄芪多糖、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、水蛭素&黄芪多糖、水蛭素&黄芪甲苷、水蛭素&毛蕊异黄酮能够不同程度降低因LPS诱导HBZY细胞增殖而升高的NF-κB、P38MAPK 蛋白的表达,水蛭素、黄芪多糖、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、水蛭素&黄芪多糖组、水蛭素&黄芪甲苷组、水蛭素&毛蕊异黄酮组均可升高因LPS诱导HEZY增殖而降低的IκB蛋白的表达,说明黄芪水蛭各有效组分及组分配伍可能通过调节P38MAPK/NF-κB通路活性,影响P38MAPK、NF-κ:B、IκB因子的表达,达到减少GMC增殖、抑制EMC沉积,延缓MsPGN病程进展的目的。