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蝎毒中蕴含了许多结构和功能多样性的神经毒素多肽，由于这些多肽的高复杂性、高同源性和高动态范围，使得蝎毒多肽的分离极具挑战。本文采用了由苯磺酸基和氰丙基组成的混合模式色谱固定相(MEX)，构建了2D-MEX×RPLC体系用于蝎毒多肽的分离分析。 7种多肽标准品在MEX色谱柱保留结果表明，MEX色谱柱的分离同时涉及到静电作用和弱疏水作用，且静电作用起主导作用。流动相中乙腈浓度的改变可以使相同电荷的多肽获得良好分离，使得MEX优于传统SCX色谱柱。流动相中盐浓度的增加会抑制静电作用力从而改变多肽的保留，但基本不影响MEX色谱柱的分离选择性。pH会影响多肽的电荷状态，因而影响了MEX色谱柱对多肽的分离选择性。MEX色谱柱对于蝎毒多肽简单组份的分离显示了比常规反相Unitary C18和混合模式C8SAX色谱柱更好的分离效果和不同的分离选择性。 在评价实验的基础上，构建了2D-MEX×RPLC体系用于蝎毒多肽的分离。优化第一维MEX色谱柱对蝎毒多肽的分离条件，分离的重复性和上样量良好。以XCharge C18串联质谱检测作为第二维，液质联用对MEX色谱柱上分离的蝎毒多肽分子量统计，结果也表明二维之间存在着不同的分离选择性，因此所构建的2D-MEX×RPLC体系对蝎毒多肽分离具有较好正交度，可达47.62％。最终利用离线的2D-MEX×C18体系，在第一维制备了20个馏份，在第二维制备了12个多肽单体，其中包括8个短链多肽和4个长链多肽。 综上所述，混合模式MEX色谱柱对蝎毒多肽有很好的分离效果，与反相色谱构建的二维色谱具有很好的正交性，可对蝎毒多肽进行有效的分离和纯化。