烧伤、创伤、休克等应激性刺激均能够造成肠黏膜屏障功能的损害，肠黏膜屏障功能受损以后，大量微生物及内毒素可以通过门静脉和淋巴系统进入体循环，从而导致机体内微生物易位和内毒素血症，进而激发机体内的细胞因子以及其它炎症介质的连锁反应，最终导致全身多个器官出现功能障碍(MODS)。因此，人们普遍认为在应激情况下肠道是导致MODS的始动器官。肠道具有众多的十分重要的功能，结构及功能完整的肠黏膜屏障对于肠道功能的发挥具有无可替代的作用，因此，在机体出现应激时如何保护肠黏膜屏障的完整性，对于维护肠道的正常功能具有十分重要的意义。肠上皮细胞增殖与凋亡之间的动态平衡对于维持肠黏膜屏障的完整性至关重要，一旦这一平衡被打破，肠上皮细胞凋亡过度将致使肠黏膜屏障的完整性受损，肠道功能也终将出现障碍。根据文献报道，机体内缺氧可出现在严重的烧、创伤等应激情况下，热休克蛋白90(HSP90)，是体内十分重要的蛋白分子伴侣之一，参与了多种细胞信号转导以及细胞功能的调节，对于应激导致的细胞凋亡具有明确的保护作用。Akt激酶是磷酸肌醇依赖激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路中的关键蛋白分子，在抑制细胞凋亡、促进细胞存活等进程中具有重要的作用；HSP90可能是Akt激酶的重要调节分子之一，它们共同参与抑制细胞的凋亡。然而，目前的文献研究中，关于缺氧能否诱导肠上皮细胞凋亡、HSP90以及PI3K/Akt信号通路是否参与抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡、及其分子机制均尚未得到十分明确阐述。综上所述，本课题将对上面提到的问题进行深入探讨。我们在前期的实验中构建了肠上皮细胞缺氧(1%O2)的模型，建立了过表达/低表达HSP90肠上皮细胞系。运用细胞增殖与活性(CCK-8)法检测各组细胞的活力、采用细胞流式和TUNEL染色技术检测细胞凋亡率，进一步观察了HSP90对于缺氧(1%O2)肠上皮细胞活力及凋亡的影响。实验结果显示：缺氧(1%O2)能够提高肠上皮细胞的凋亡率，缺氧时间延长至12h时肠上皮细胞凋亡率最为显著，并且缺氧时间与细胞凋亡率呈正比关系；随着缺氧时间的延长，细胞活力也逐渐下降；在缺氧12h这一时间点，与正常肠上皮细胞组相比，过表达HSP90的肠上皮细胞组的细胞凋亡率明显下降；与此相反，低表达HSP90的肠上皮细胞组的细胞凋亡率显著增高。这一实验结果表明，HSP90可以抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡，对于细胞的凋亡损害具有重要的保护作用。接着，我们采用多种不同的信号激酶抑制剂作用各组肠上皮细胞，运用流式细胞技术检测各组缺氧细胞的凋亡率，探讨哪一条或几条信号传导通路在缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡中发挥主要作用。实验结果证实，缺氧(1%O2)12h后，与其他抑制剂细胞组相比较，LY294002，作为Akt激酶特异性阻断剂，处理后的肠上皮细胞组凋亡率最为显著； LY294002作用过表达HSP90肠上皮细胞后，与单纯的过表达组细胞相比，LY294002组细胞凋亡率显著增高，这一结果证实：Akt信号通路在HSP90保护缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡损害这一进程中具有举足轻重的作用。前期的研究我们已经证实HSP90和Akt信号通路参与抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡，但是，其具体的分子机制是什么，在Akt信号通路中，哪些主要蛋白质分子在这一过程中发挥了关键的作用呢？接着，我们采用WB蛋白免疫印迹技术，检测了在正常和缺氧(1%O2)情况下肠上皮细胞Akt通路中的多种相关效应分子Akt、PI3K、 PDK1、 Bcl-2蛋白，以及BAD、细胞色素c(cytochrome c)、caspase3、 PARP的蛋白质表达。实验结果显示：与正常细胞组相比，缺氧处理12h后，Akt激酶活性的增高；与单纯缺氧细胞组相比，过表达HSP90肠上皮细胞组磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达水平进一步升高；反之，低表达HSP90肠上皮细胞组p-Akt蛋白表达水平明显降低；但是，Akt上游的PI3K,、PDK1分子蛋白无明显变化。从而提示，机体缺氧仅能够激活Akt信号通路中的Akt蛋白激酶；在缺氧肠上皮细胞中，HSP90能够增强Akt的磷酸化，维持Akt激酶的活性，而HSP90增强Akt磷酸化的作用并不是通过PI3K、PDK1来实现的。BAD和cytochrome c是线粒体凋亡通路中的两个重要蛋白分子，在调控细胞凋亡进程中作用显著。我们的实验结果表明，与正常对照细胞组相比，缺氧处理细胞12h后，磷酸化BAD(p-BAD)蛋白水平表达升高，cytochrome c表达亦升高；与单纯缺氧12h细胞组相比，过表达HSP90肠上皮细胞组磷酸化p-BAD蛋白质水平显著升高，而cytochrome c表达降低；与此结果相反，低表达HSP90肠上皮细胞组p-BAD水平显著下低，而cytochrome c表达水平显著升高。结果证实，HSP90能够提高p-BAD蛋白表达，降低cytochrome c蛋白表达。caspase3和PARP是细胞凋亡的重要执行分子，和正常对照组相比，在缺氧处理细胞12h后上述两个蛋白分子表达升高，在过表达HSP90肠上皮细胞组中，两者表达均显著降低；与此相反，在低表达HSP90肠上皮细胞组中，两者活性均显著升高，进而从分子层面阐明了HSP90能够抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡损害。那么，HSP90与p-Akt之间是否具有相互作用呢？实验采用免疫荧光共定位技术，观察了HSP90与磷酸化Akt的相互作用，免疫荧光共定位观察到两者在细胞内的共定位情况；采用免疫共沉淀技术，结果表明，与对照组相比较，过表达HSP90肠上皮细胞组p-Akt水平显著增高，而低表达HSP90肠上皮细胞组p-Akt水平明显下低，证实了HSP90与p-Akt之间相互作用。在动物实验中，建立严重烧伤后小鼠模型，证明HSP90能够显著减轻严重烧伤后小鼠肠黏膜的损害程度，对小鼠肠黏膜完整性具有十分良好的保护作用。综上所述，严重烧、创伤后机体缺氧能够诱导肠上皮细胞凋亡，破坏肠黏膜的完整性；体外与体内实验中，我们证实了HSP90能够抑制缺氧诱导的肠上皮细胞凋亡，减轻肠黏膜屏障损害程度。其机制主要是HSP90通过与Akt之间相互作用，增强p-Akt蛋白表达，维持其活性，Akt进而激活p-BAD、减少cytochrome c从线粒体内释放至细胞质，进而抑制肠上皮细胞细胞凋亡caspase级联反应。HSP90为严重烧、创伤后缺氧导致的肠上皮细胞凋亡损害的预防和治疗提供了一个潜在的、有效的基因治疗靶点。