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研究背景间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（interstitial cystitis/bladder painful syndrome,IC/BPS）是与膀胱有关的慢性盆腔疼痛综合征,通常伴有尿急或尿频。IC/BPS疼痛主要由膀胱充盈末期膀胱充盈的机械刺激诱发,排尿后减轻,因而具有明显的机械敏感性特征。正常人膀胱充盈的机械刺激不会引起疼痛,因而,IC/BPS疼痛从病理机制上属于机械痛觉感受异常（Mechanical allodynia）的范畴。目前这一机械敏感性疼痛发生的病理生理学机制还不清楚。已有研究表明:支配膀胱的外周感觉神经敏化是IC/BPS疼痛发生的重要病理机制。而膀胱感觉神经表达的感觉离子通道例如TRPV1、TRPA1、TRPV4等的表达及功能的上调参与了膀胱外周感觉神经的敏化,进而导致了 IC/BPS疼痛的发生。同时外周感觉神经的敏化也是导致膀胱过度活动（Overactive bladder,OAB）的重要病理生理机制。Piezo2通道是2010年由Coste及Patapoutian等人发现的机械感受性离子通道。Patapoutian也因此获得了 2021年诺贝尔医学生理奖。Patapoutian等最近发表在Nature的一项研究阐明了 Piezo2在膀胱机械感受中的重要作用:Piezo2表达于支配膀胱的背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）感觉神经元,在膀胱粘膜上皮伞状细胞也有表达,Piezo2通道缺失的人表现为膀胱充盈感的减弱或缺失及排尿频率的降低。Piezo2 knockout的小鼠表现为排尿间隔延长及膀胱顺应性受损。但这些Piezo2在膀胱研究领域的最新发现并未揭示Piezo2在病理情况下,例如膀胱疼痛及膀胱过度活动时的作用。最近的研究表明:除表达于非伤害性感觉神经元外,Piezo2通道也表达于感受疼痛的小胞体发出无髓鞘C纤维的外周伤害性感觉神经元（Nociceptor）上,被证实参与伤害性的机械痛觉感受,以及病理情况下机械刺激引起的痛觉过敏及痛性感觉异常的发生。但Piezo2是否参与了 IC/BPS机械敏感性的疼痛的发生还未见报道。膀胱内神经生长因子NGF（Nerve growth factor）增多是IC/BPS慢性疼发生的公认机制。最近在皮肤炎性疼及骨痛的研究表明:Piezo2通道是NGF等炎性因子敏化外周神经导致机械敏感性慢性痛的另一下游靶点。NGF敏化外周感觉神经的作用可被Piezo2通道的敲低而减弱。但NGF是否通过上调Piezo2通道参与IC/BPS外周神经敏感化的发生还未见报道。研究目的本研究以大鼠腹腔注射环磷酰胺（CYP）为IC/BPS模型,以支配膀胱的DRG神经元为主要研究对象,主要探讨:（1）感觉神经Piezo2通道在IC/BPS机械敏感性疼痛发生中的作用;（2）感觉神经Piezo2通道在膀胱过度活动（OAB）发生中的作用;（3）NGF这一在IC/BPS疼痛发生中起重要作用的炎性介质对感觉神经Piezo2通道的调控作用及可能的胞内途径。进而为IC/BPS提供新理论及新的治疗靶点。研究方法1.大鼠腹腔注射CYP建立IC/BPS模型;2.鞘内注射Piezo2 mRNA的反义寡核苷酸（Antisense）敲低感觉神经上Piezo2表达,以注射Piezo2mRNA的Mismatch作为对照。大鼠分为正常、CYP、CYP+Antisense、CYP+Mismatch 四组;3.DiI染料逆行示踪结合免疫荧光,观察Piezo2在支配膀胱的DRG神经元胞体上的表达;4.膀胱粘膜Whole-mount神经免疫荧光观察Piezo2在膀胱外周感觉神经末梢上的表达,并观察与辣椒素受体TRPV1、降钙素基因相关肽（CGRP）及植物血凝素IB4的共表达;5.mRNA荧光原位杂交（FISH）定量观察比较四组大鼠膀胱DRG神经元Piezo2 mRNA表达水平的差异;6.Western Blot（WB）定量观察比较四组大鼠L6-S1 DRGs神经元Piezo2蛋白表达的差异;7.钙成像技术定量观察比较正常与CYP大鼠膀胱DRG神经元Piezo2功能表达的差异;8.Von-Frey机械丝刺激下腹部膀胱区,观察四组大鼠疼痛行为的差别;9.膀胱压力—容积测定（CMG）和尿斑实验观察四组大鼠排尿行为的差别;10.免疫荧光观察Piezo2与NGF高亲和力受体TrkA在L6-S1 DRGs神经元的共表达;11.钙成像技术观察NGF孵育DRG神经元后,对机械刺激诱发的胞内Ca2+升高水平的影响以及PKC、PI3K、ERK1/2阻断剂的阻断作用。研究结果1.与正常大鼠相比,CYP大鼠机械刺激诱发的疼痛反应增强,表现为机械痛觉过敏。CMG记录显示:排尿间期缩短,排尿反射的压力阈值降低;尿斑实验显示:排尿次数增多,每次排尿量减少,呈现OAB表现。膀胱肉眼呈现明显的充血水肿,HE染色可见粘膜溃疡及粘膜下水肿。这些结果表明IC/BPS模型大鼠成功建立。2.支配大鼠膀胱的感觉神经元（DRG）胞体及神经末梢上均有Piezo2表达,特别是表达TRPV1、CGRP及IB4的痛觉感受神经末梢上有Piezo2表达;3.FISH结果显示:与正常大鼠相比,CYP及CYP+Mismatch大鼠膀胱DRG神经元Piezo2的mRNA表达水平升高,敲低Piezo2表达后（CYP+Antisense）,Piezo2的mRNA表达水平下降;4.WB结果显示:与正常大鼠相比,CYP及CYP+Mismatch大鼠L6-S1 DRGs Piezo2的蛋白表达水平升高,敲低Piezo2表达后（CYP+Antisense）,蛋白表达水平下降;5.钙离子成像显示:机械刺激膀胱DRG神经元可诱发Ca2+升高,该升高可被Piezo2非特异性阻断剂蜘蛛毒素肽（GsMTx4）阻断,且Piezo2敲低后降低,说明由Piezo2介导。与正常大鼠相比,机械刺激CYP大鼠DRG神经元诱发的Ca2+升高幅度增加,说明Piezo2功能表达增强。6.痛行为学结果显示:与正常大鼠相比,CYP及CYP+Mismatch大鼠对机械刺激诱发的疼痛行为反应增强,也即疼痛机械敏感性增加,敲低Piezo2表达后（CYP+Antisense）,机械敏感性疼痛减轻;7.排尿行为测定结果显示:与正常大鼠相比,CYP及CYP+Mismatch大鼠排尿间期缩短,排尿频率增加,排尿反射的压力阈值降低,表现为OAB,敲低Piezo2表达后（CYP+Antisense）OAB 表现减轻;8.Piezo2与NGF高亲和力受体TrkA在L6-S1 DRGs神经元有共表达,NGF孵育DRG神经元可增强Piezo2介导的机械刺激诱发的Ca2+升高幅度;阻断ERK通路,可减弱NGF增强Piezo2介导的胞内钙离子升高的作用。结论支配膀胱的感觉神经上Piezo2表达的上调参与了 IC/BPS机械敏感性疼痛和OAB的发生。膀胱内NGF增多,通过TrkA受体进而激活ERK通路导致Piezo2功能的增强,可能是Piezo2上调的重要胞内机制。降低Piezo2表达或以其特异性阻断剂抑制其功能可以减轻IC/BPS机械敏感性疼痛及OAB表现,以Piezo2通道为靶点开发治疗IC/BPS机械敏感性疼痛的药物应该是一个新的方向。