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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国的重要水产养殖品种,2006年,草鱼产量达396.3万吨,是产量最高的养殖品种,占中国淡水养殖总产量的20%,然而,养殖品种退化和病害频发严重制约着草鱼养殖业的发展,2006年,草鱼养殖业因病害造成的经济损失达21.26亿元人民币。由于草鱼繁殖周期长,传统遗传选育策略面临巨大挑战,事实上,截至目前尚未能培育出一个优良的草鱼养殖品种。显然,草鱼分子遗传学背景的深入系统研究,对建立草鱼分子育种技术体系,加快草鱼优良养殖品种的培育具有重要意义。本研究采用基因组学研究方法,对草鱼免疫相关基因进行了比较研究,主要研究结果如下: 1.以草鱼头肾组织为材料,采用SMART技术,成功构建了草鱼头肾组织全长cDNA文库。经测定,该文库容量为6×105,重组率为97.85%;插入片段的长度大于1kb。随机挑取10464个克隆进行测序,获得7921条高质量ESTs,初步拼接得到3027个单基因簇(Unigene),其中包括852个重叠群(Contig),2175个单拷贝EST(Singlet),冗余度(redundancy)为61.78%。使用BLAST软件将这些序列同GenBank等数据库进行比对、查询、注释和分类。结果显示2646条序列有相关同源性(E<1e-5),其他的381(12.59%)条序列没有明显的同源性,但是也同时揭示出在这些ESTs中能够发现新功能基因的相当可能性。以COG和KEGG数据库做功能分类,结果都显示,最多的几类包括翻译后修饰、蛋白折叠,核糖体的结构形成,能量产生和转换,活跃表达的基因主要在维持生命活动的必须基因,说明健康草鱼头肾组织中是以基础代谢、生长发育作为它主要的生命过程。 2.以草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of Grass carp,GCRV)对草鱼进行人工感染,运用solexa系统研究健康草鱼(CP)及感染后66小时(VP)头肾组织中基因表达谱的差异。两种样品的原始测序量分别为7696804(CP)和6136889(VP),动态监测范围达5个数量级。以NCBI中草鱼、斑马鱼的序列及本研究中所测草鱼头肾cDNA文库序列为参考库对标签注释,在CP和VP库中,分别有13.55%和15.13%的特有tag能与参考库比对上,两个库只用到参考库约30%的基因。在比对得出的6523个差异表达基因中,在P值小于0.01的条件下,有1765个差异显著的基因,其中表达上调的有639个,表达量降低的1126个。对差异基因做pathway功能富集表明有22个通路受到显著影响,包括9个代谢通路、3个遗传信息处理通路、1个环境信息处理通路、3个细胞过程通路和5个人类疾病通路。这说明GCRV的感染对草鱼头肾组织的多种信号传输及表达调控都产生了影响,不仅免疫相关通路的基因表达发生了变化,神经、行为等其他方面的生物分子活动也有波动。对其中与免疫相关的三个通路白细胞跨内皮迁移、抗原呈递及JAK-STAT信号通路中差异表达基因的分析发现,在我们所选择的病毒感染66小时后的数条草鱼体内,鱼体积极地调动了全身从免疫器官到免疫细胞到各种免疫分子的应答活动,却不敌病毒强大的攻击,产生多处凋亡信号,最终衰竭致死。 3.将差异表达基因以与免疫相关、无关、无注释为标准分为三类,分别以VHSV病毒诱导基因X(VIG-X)、卵黄膜外层蛋白1(VMO1)、干扰素诱导基因12(ISG12)为代表基因做初步研究。获得VIG-X、VMO1、ISG12三个基因的全长,分别为1366bp、1440bp、550bp,编码区分别为804bp、615bp、297bp。与斑马鱼相应基因比对扩增出三个基因的基因组序列,分别为2669bp、1952bp、1143bp。组织表达分析显示,ISG12和VMO1在草鱼成鱼各个组织均有表达,VIG-X在除后肠外其他组织中均有表达。通过RT-PCR对三个基因在GCRV感染草鱼病程中表达量分析显示,ISG12和VIG-X表达规律相似,都是在感染后54小时表达量最高,ISG12的波动幅度较大。而VMO1是在感染后18小时就达到最高表达量。