生物标志物(biomarker)是一类用来标记正常生理学过程的生化指标,它可用来衡量有机体的健康状况。通过测量它可以判断某种疾病的发生和分型,监测疾病的严重程度,预测个体发生某种疾病的风险,筛查高危人群中某种疾病的发病概率或评价新药对疾病的有效性等。近年来,寻求特异性的生物标志物,发展灵敏、快捷的生物标志物的检测方法已成为生命科学领域的研究热点。免疫传感器是生物敏感元件为抗体或抗原的生物传感器,它是将高灵敏的生物传感技术与高特异性的免疫分析相结合,用来检测抗原或抗体含量的方法。相对于其他检测技术,免疫传感器具有特异性强、灵敏度高、样品不需要复杂的预处理等诸多优点,已发展为生物标志物最重要的检测手段。但是在目前,大多数免疫传感器的研究仍处于实验阶段,无法满足临床上低检出限、高稳定性以及实时快速检测的要求。因此,免疫传感器将朝着以下方向发展:(1)与新型纳米技术相结合,通过开发性能优异的纳米材料,增强其在复杂样品中的稳定性以及与生物分子的结合效率,从而提高传感器的灵敏度;(2)与试纸条或智能手机等新型检测平台相结合,来实现对生物标志物的现场快速检测。基于此,本论文首先制备了几种新型纳米材料,将其用于生物标志物的检测,来提高免疫传感器的灵敏度。然后,我们将纳米材料与便携式检测平台相结合,以期在保证免疫传感器高灵敏度的同时,实现生物标志物的现场快速检测。具体研究内容如下:1、构建了基于阳离子交换反应的荧光/电化学双模式免疫传感器用于癌胚抗原(CEA)的灵敏性检测本研究利用阳离子交换反应发展了一种荧光/电化学双模式免疫传感平台来准确且灵敏的检测生物标志物。在这里,我们选用一种广谱的癌症标志物—癌胚抗原(CEA)作为模型分析物。传感器的构建如下:首先将Fe304 NPs结合CEA捕获抗体(Ab1)形成Fe3O4-Ab1复合物,然后采用PAMAM作为交联剂,将 CNTs、CdSe NCs、Ab2 结合形成 CNTs-PAMAM-CdSe NCs-Ab2纳米探针。当有目标物CEA存在时,其首先被Fe3O4 NPs-Ab1捕获,然后再被CNTs-PAMAM-CdSe NCs-Ab2 免疫探针识别,最后形成 Fe3O4 NPs-Ab1-CEA-Ab2-CdSe NCs-PAMAM-CNTs。然后加入Ag+与CdSe NCs反应,释放出大量的Cd21,采用电化学方法直接检测Cd2+,或者加入Cd24敏感的荧光染料(Rhod-5N),通过荧光信号来检测。两种方法对于CEA的线性范围分别为5 pg/mL～50 ng/mL和1 pg/mL～20 ng/mL,检出限分别低至1.7 pg/mL和0.25 pg/mL。由于阳离子交换反应能极大的放大检出信号,使本方法具有较高的灵敏性,同时两种信号输出还能弥补彼此的不足,使得检测结果更加准确可靠。因此,该免疫传感器在生物标志物的临床应用上展现了巨大的潜力。2、构建了基于PtSn NCs和Fe3O4 NPs协同催化效应的电化学/比色双模式免疫细胞传感器用于A549细胞的检测在本研究中,我们制备了一种具有超高催化活性的纳米复合物作为免疫分析的探针,用来准确且灵敏的检测肺癌细胞A549。纳米探针是通过将具有高能晶面的PtSn纳米晶体(PtSn NCs)组装到Fe3O4 NPs表面形成的Fe3O4-PtSn NPs纳米复合物。该纳米探针不仅具有优良的电催化活性,还展现了极佳的类酶活性,基于此,我们发展了一种电化学/比色双模式免疫传感器检测A549细胞。针对电化学检测,我们首先采用还原氧化石墨烯、Au NPs和透明质酸形成复合物(rGO/Au NPs/HA)修饰玻碳电极,通过HA与其受体(细胞表面糖蛋白CD 44)的相互作用来捕获A549细胞,然后采用CD 44蛋白的抗体(anti-CD 44)结合Fe3O4-PtSn NPs形成纳米探针(anti-CD 44/PtSn-Fe3O4)来特异性的识别电极上被捕获的目标物。通过Fe3O4-PtSn NPs催化底物产生的电信号来确定目标物的含量。针对比色检测,我们直接将不同浓度的A549细胞注入96孔板中,待细胞贴壁之后,加入探针anti-CD44/PtSn-Fe3O4孵化。然后加入底物TMB,根据颜色的变化来直观的判断细胞的含量,或者用酶标仪定量测量细胞浓度,该方法不仅容易实施而且结果稳定直观。由于PtSn NCs高的表面能,其本身就展现了高的催化活性,当PtSn NCs与Fe3O4 NPs组装后,两者还发挥了协同催化作用,因而该探针能显著地增强检测信号,使得两种方法的检出限分别低至3个和8个细胞。因此,我们使用一种具有高催化活性的纳米探针发展了两种针对A549细胞的检测方法,两种方法均展现了高的灵敏度,且彼此之间能扬长避短,相互补充,增强检测结果的准确性和可靠性,在癌症的早期检测上具有较高的应用价值。3、构建了基于包埋葡萄糖的脂质体和便携式血糖仪的免疫传感器用于磷化蛋白phospho-P5315的检测本研究发展了一种便携、经济且应用广泛的新型便携式免疫传感器用于磷化蛋白phospho-p5315(15号位点发生磷酸化)的检测。首先,我们将phospho-p5315捕获抗体(Ab1)固定在Fe3O4磁珠上,形成Fe3O4-Ab1来捕获phospho-p5315,然后该复合物被检测抗体(Ab2)结合的脂质体(Ab2-GEL)所识别。最后加入Triton X-100破坏所捕获的脂质体膜,释放出包埋在脂质体中的葡萄糖分子,用商品化的血糖仪检测,其线性范围位于0.1～100 ng/mL,检出限可达50 pg/mL。本方法创新性的将目标物的含量对应转化为葡萄糖的含量,通过用商品化便携式的血糖仪检测葡萄糖的含量来实现目标物的检测,扩宽了血糖仪的使用范围。脂质体大的内腔可以包埋成千上万个葡萄糖分子,因而将脂质体作为信号分子载体极大的提高了检测方法的灵敏度。因此,本方法具有快速、低成本、便携式、高灵敏等诸多优点。此外,我们还可将该方法延伸至检测一系列非葡萄糖目标物,为生物标志物的便携式检测提供了一种新思路。4、构建了基于纳米酶和智能手机背景光感应平台的免疫传感器用于有机磷农药暴露后生物标志物的检测本研究利用手机背景光传感器和免疫层析试纸条(ICTS)来检测有机磷农药暴露后的生物标志物—丁酰胆碱酯酶(BChE)。该检测通过同时测定有机磷农药暴露后BChE的总量和活性来实现。我们首先采用3D 打印技术设计了一个与智能手机配套的小装置,该装置安装有一个正好放置一根ICTS的小槽,在正对着ICTS检测线的上方安装一个LED灯。BChE总量是通过免疫夹心法来检测,具体而言,我们采用具有类酶活性的PtPd NPs作为探针,该探针能被定量的捕获在ICTS的检测线上,加入底物儿茶酚生成黑棕色产物,使LED灯发射过来的光强度减弱,该光强度的变化即可反映出BChE总量的变化。BChE的活性通过在试纸条的检测线上进行Ellman测试来实现。这种基于ICTS的背景光感应平台对于BChE的总量和活性分别在0.05～6.4 nM和0.1～6.4 nM范围内表现优良的线性关系。该方法由于具有卓越的便携性、极快的分析速度、低廉的分析成本和高的灵敏度,在临床诊断、环境监测、食品安全等众多领域展现了极大的应用潜力。