目的:脑缺血性疾病具有发病率、致残率、死亡率高，知晓率、治疗率、控制率低等特点，严重威胁着人类的生命健康。且随着我国老龄化社会的到来，此类疾病的严峻形势不容忽视。近年来，许多科研人员致力于调动机体内源性保护机制以提高脑神经细胞对缺血性损害的抵抗力的研究，使其在遭受严重的缺血打击并恢复血液灌流后仍具有正常的生理功能，为此类疾病的防治提供新思路。　　自1990年日本学者Kitagawa发现脑缺血预处理现象以来，大量研究证实了同一器官缺血预处理所带来的保护作用。尽管脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受具有强大的内源性保护作用，然而对中枢器官进行缺血预处理，很难作为一种脑缺血前的预防措施直接应用于临床。随着对缺血预处理研究的进一步深入，许多研究者发现并证实了远隔器官缺血预处理的保护作用。远隔器官缺血预处理是指预先对靶器官以外的组织或器官进行缺血预处理，使靶器官产生缺血耐受的现象。这一发现实现了采用非重要生命器官缺血预处理对抗重要生命器官的缺血再灌注损伤，具有更好的可操作性与安全性。　　我们近些年的研究证实，反复3次双侧股动脉夹闭和开放的肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning，LIP)可减轻随后即刻发生的脑缺血再灌注引起的大鼠海马CA1区锥体神经元的延迟性死亡和凋亡、诱导脑缺血耐受。随后，我们在进一步的研究中发现LIP可通过上调大鼠海马CA1区p38 MAPK、ERK、HSP70以及Ngb等的表达，抑制凋亡通路，改变SOD活性等途径，诱导大鼠脑缺血耐受。然而，缺血预处理的肢体与遭受缺血打击的大脑相隔较远，由LIP启动的内源性保护信号如何作用于脑，其机制尚不完全清楚。2009年，加拿大学者Shimizu等在家兔离体心脏和心肌症模型中发现，将LIP诱导的心肌缺血耐受的家兔血浆和血浆透析液给予单纯心肌缺血的家兔，同样可以保护受损的心肌，这说明LIP可通过体液途径发挥远隔器官或组织的保护作用。随着研究的进一步深入，后来人们又发现了自由基、腺苷等体液因子参与了此过程:在脊髓的缺血再灌注损伤模型中，于LIP前静脉内给予自由基清除剂DMTU能逆转LIP的脊髓保护作用，提示LIP可通过自由基发挥保护作用;2014年，Montero等研究发现，在小肠缺血再灌注损伤模型中，静脉给予腺苷可减轻由小肠缺血再灌注所继发的心脏损害，提示腺苷发挥了远隔器官的保护作用。那么，LIP能否通过体液因子腺苷及自由基诱导脑缺血耐受？同时这些体液因子是否能上调此过程中p38 MAPK和ERK的表达呢？　　因此，本课题的研究目的在于:①自由基及腺苷在LIP诱导的大鼠脑缺血耐受中的作用;②自由基及腺苷在LIP诱导的大鼠海马CA1区p38 MAPK和ERK表达上调中的作用。通过对上述问题的研究，以期为LIP的脑保护作用提供充实的实验依据，有助于更全面地认识LIP脑保护作用的机制。　　方法与结果:　　1、自由基及腺苷在LIP诱导的大鼠脑缺血耐受中的作用　　1.1自由基清除剂DMTU对LIP诱导的大鼠脑缺血耐受的影响　　动物分组:雄性Wistar大鼠80只，永久凝闭双侧椎动脉后恢复两天，随机分为以下5组:①全脑缺血的sham组(n=10):只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流;②全脑缺血(brain ischemia，BI)组(n=10):夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注;③LIP+BI组(n=10):夹闭双侧股动脉10 min、再灌注10 min，反复3次作为LIP后，即刻夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血，然后恢复再灌注;④DMTU+LIP+BI组(n=40):于LIP前1h股静脉内注射自由基清除剂DMTU后，即刻给予8 min全脑缺血， DMTU进一步分为0 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg和750 mg/kg4个亚组;⑤DMTU+sham组(n=10):股静脉内注射DMTU(500 mg/kg)，1h后暴露双侧颈总动脉。　　实验方法:①硫堇染色:以上各组（含亚组）大鼠分别取6只在末次手术后7d断头取脑，冠状切取视交叉后1～4 mm脑片，常规组织切片，进行硫堇染色，观察迟发性神经元损伤程度。低倍镜下观察硫堇染色的海马组织形态，参照Kitagawa(1990)和Kato(1991)分级方法，对海马CA1区确定组织学分级(histological grade，HG)，标准如下:0级:无神经元死亡;Ⅰ级:散在神经元死亡;Ⅱ级:成片神经元死亡;Ⅲ级:几乎全部神经元死亡。高倍显微镜下计数双侧海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段，取平均数作为神经元密度(neuronal density, ND)，作为判定迟发性神经元损伤程度的依据;②SOD、MDA测定:各组（含亚组）其余4只大鼠在末次手术后3天于右心室采集血液后，按照试剂盒使用说明测定血清中SOD活力及MDA的含量。　　实验结果:①硫堇染色结果显示，全脑缺血的sham组、DMTU500+ sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密，层数为2～3层，细胞形态完整、边界清晰，无细胞缺失，胞核饱满、核仁深染、清晰，无明显的延迟性神经元死亡（delayed neuronal death，DND），HG为0级，ND值分别为219.11±12.45(cells/mm，下同)、216.00±9.45。BI组大鼠海马CA1区出现明显的DND，锥体细胞形态改变明显，几乎全部神经元死亡或缺失，与全脑缺血的sham组相比，HG（Ⅲ级）明显升高(P＜0.01)，ND（48.67±4.34）值明显降低（P＜0.01）。在LIP+BI组、DMTU0+LIP+ BI组海马CA1区锥体神经元未见明显损伤，仅个别细胞胞核固缩，细胞排列整齐，无明显细胞缺失，HG为0～Ⅰ级，ND值分别为212.44±26.35、209.67±23.78。LIP+BI组与BI组相比，HG明显降低(P＜0.01)、ND值明显升高(P＜0.01)。DMTU250+LIP+BI组、DMTU500+LIP+BI组、DMTU750+LIP+BI组大鼠海马CA1区锥体神经元均有明显组织学损伤，细胞形态发生改变，成片死亡或缺失，HG为Ⅰ～Ⅱ级，ND值分别为153.44±27.20、121.33±18.37和123.78±28.75，与LIP+BI组相比，HG升高(P＜0.01)，ND值明显降低(P＜0.01)。此外，DMTU500+LIP+BI组与DMTU750+LIP+BI组间无明显统计学差异。上述结果表明:LIP明显减轻了大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区迟发性神经元死亡、发挥了脑保护作用;LIP前股静脉内注射自由基清除剂DMTU可部分阻断LIP的脑保护作用，且DMTU的最佳剂量为500 mg/kg，提示体液因子自由基部分参与了LIP诱导的脑缺血耐受。②血清SOD活力、MDA含量结果显示:BI组大鼠血清SOD活力为161.73±7.86（U/ml，下同），MDA含量为13.41±1.22（nmol/ml，下同）。与BI组相比，LIP+BI组大鼠血清SOD活力（204.02±12.43）明显增加(P＜0.01)，MDA含量（7.65±0.85）明显下降(P＜0.01)。与LIP+BI组相比，DMTU500+LIP+BI组大鼠血清SOD活力（182.30±11.33）明显下降(P＜0.01)，MDA含量（11.08±1.55）明显上升(P＜0.01)。上述结果表明，体液因子自由基可部分通过上调SOD活力、降低MDA含量参与LIP诱导的大鼠脑缺血耐受。　　1.2腺苷A1受体拮抗剂DPCPX对LIP诱导的大鼠脑缺血耐受的影响　　动物分组:雄性Wistar大鼠80只，永久凝闭双侧椎动脉后恢复两天，随机分为以下5组:①全脑缺血的sham组(n=10):只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流;②BI组(n=10):夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注;③LIP+BI组(n=10):夹闭双侧股动脉10 min、再灌注10 min，反复3次作为LIP后，即刻夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血，然后恢复再灌注;④DPCPX+LIP+BI组(n=40):于LIP前5 min股静脉内注射腺苷A1受体拮抗剂DPCPX，即刻给予8 min全脑缺血，DPCPX进一步分为0 nmol/kg、16 nmol/kg、32 nmol/kg和48 nmol/kg4个亚组;⑤DPCPX+sham组(n=10):股静脉内注射腺苷A1受体拮抗剂DPCPX(32nmol/kg)，5 min后暴露双侧颈总动脉。　　实验方法同1.1　　实验结果:①硫(堇)染色结果显示，全脑缺血的sham组、DPCPX32+ sham组大鼠海马CA1区锥体细胞无明显的DND，HG为0级、ND值分别为221.89±10.08和213.22±12.77。BI组大鼠海马CA1区有明显的组织学损伤，出现严重的DND，与全脑缺血的sham组相比，HG(Ⅲ级)明显升高(P＜0.01)，ND值（46.56±6.45）明显降低(P＜0.01)。LIP+BI组、DPCPX0+LIP+BI组海马CA1区锥体神经仅个别细胞胞核固缩，无明显缺失，HG为0～I级，ND值分别为211.56±15.59、213.00±14.67。LIP+BI组与BI组相比，HG明显降低(P＜0.01)、ND值明显升高(P＜0.01)。DPCPX16+LIP+BI组海马CA1区锥体神经元形态发生改变，散在死亡或缺失，HG为Ⅰ～Ⅱ级，ND值为124.56±28.05，与LIP+BI组相比，HG升高（P＜0.01），ND值明显降低(P＜0.01)。DPCPX32+LIP+ BI组与DPCPX48+LIP+BI组海马CA1区锥体神经元损伤明显，成片死亡或缺失，HG为Ⅱ～Ⅲ级，ND值分别为77.00±32.25、71.44±28.84，与LIP+BI组相比，HG升高(P＜0.01)，ND值明显降低(P＜0.01)。上述结果表明:LIP明显减轻了大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区DND，发挥了脑保护作用;LIP前股静脉内注射腺苷A1受体拮抗剂DPCPX可部分阻断LIP的脑保护作用，且DPCPX的最佳剂量为32nmol/kg，提示体液因子腺苷参与了LIP诱导的脑缺血耐受。②血清SOD活力、MDA含量结果显示:与BI组相比，LIP+BI组大鼠血清SOD活力（204.02±12.43）明显增加(P＜0.01)，MDA含量（7.65±0.85）明显下降(P＜0.01)。与LIP+BI组相比，DPCPX32+LIP+BI组大鼠血清SOD活力（175.07±11.18）明显下降（P＜0.01），MDA含量(12.01±1.02)明显上升(P＜0.01)。上述结果表明，体液因子腺苷可部分通过上调SOD活力、降低MDA含量参与LIP诱导的大鼠脑缺血耐受。　　1.3腺苷(Ade)对大鼠脑缺血的影响　　动物分组:雄性Wistar大鼠70只，永久凝闭双侧椎动脉后恢复两天，随机分为以下4组:①全脑缺血的sham组(n=10):只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流;②BI组(n=10):夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注;③Ade+BI组(n=40):于BI前10 min股静脉内注射腺苷，其余步骤同BI组，腺苷进一步分为0 nmol/kg、10 nmol/kg、20 nmol/kg和40nmol/kg4个亚组;④Ade+sham组(n=10):股静脉内注射腺苷(20nmol/kg)，10 min后暴露双侧颈总动脉。　　实验方法同1.1　　实验结果:①硫堇染色结果显示，全脑缺血的sham组、Ade20+sham组大鼠海马CA1区锥体细胞无明显的DND。BI组、Ade0+BI组CA1区组织学损伤明显，几乎全部神经元死亡或缺失，HG为Ⅲ级，ND值分别为46.89±7.01、45.89±4.89。BI组与全脑缺血的sham组相比，HG明显升高（P＜0.01），ND值明显降低（P＜0.01）。Ade10+BI组海马CA1区锥体神经元有较明显组织学损伤，HG为Ⅰ～Ⅱ级，ND值为145.11±29.04，与BI组相比，HG降低(P＜0.01)、ND值升高(P＜0.01)。Ade20+BI组、Ade40+BI组CA1区锥体神经元仅有散在死亡，HG分别为0～Ⅱ、0～Ⅰ级，ND值分别为183.44±30.84、193.44±10.80，与BI组相比，HG显著降低(P＜0.01)、ND值显著升高(P＜0.01)。综上，腺苷能较好地模拟LIP的脑保护作用，其最佳剂量为20 nmol/kg，进一步提示体液因子腺苷参与了脑缺血耐受的诱导。②血清SOD活力、MDA含量结果表明:BI组大鼠血清SOD活力为161.73±7.86，MDA含量为13.41±1.22。与BI组相比，Ade20+BI组大鼠血清SOD活力（190.14±7.41）明显增加(P＜0.01)，MDA含量（8.24±0.84）有明显下降(P＜0.01)。上述结果进一步表明，体液因子腺苷可通过上调血清SOD活力、降低MDA含量参与大鼠脑缺血耐受的诱导。　　2自由基及腺苷在LIP诱导的大鼠海马CA1区p38 MAPK和ERK表达上调中的作用　　2.1自由基清除剂DMTU对LIP诱导的大鼠海马CA1区p38 MAPK和ERK表达的影响　　动物分组同1.1　　实验方法:①免疫组织化学法:以上各组（含亚组）大鼠分别取5只在末次手术后12h断头取脑，冠状切取视交叉后1～4 mm脑片，常规组织切片，用p-p38 MAPK或p-ERK抗体分别标记p-p38 MAPK或p-ERK，DAB显色后，应用显微图像分析系统测定阳性细胞显色面积及积分光密度，相对定量分析p-p38 MAPK和p-ERK蛋白表达的变化;②Western blot法:各组（含亚组）其余5只大鼠在末次手术后12 h取海马脑组织，按Western blot常规方法制备待测样品，凝胶电泳、抗体孵育后，应用凝胶成像分析系统对电泳条带进行分析处理，相对定量分析p-p38 MAPK、p-ERK蛋白的表达。　　实验结果:①免疫组化结果显示:全脑缺血的sham组、BI组和DMTU500+sham组大鼠海马CA1区p-p38 MAPK与p-ERK阳性表达较少，阳性细胞胞核着色且较浅，呈棕黄色，p-p38 MAPK的积分光密度分别为12.23±1.52、12.42±1.81和11.95±1.30，p-ERK的积分光密度分别为4.60±0.19、4.75±0.23和4.65±0.20，p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为5366.53±926.59(μm2，下同)、5783.77±874.26和5582.38±887.95，p-ERK的阳性细胞总面积分别为3395.34±291.14、3453.57±374.73和3610.90±210.03。LIP+BI组、DMTU0+LIP+BI组CA1区p-p38 MAPK和p-ERK的阳性表达明显增多，胞核深染，呈深棕黄色，p-p38 MAPK的积分光密度分别为68.57±6.87和66.37±5.03，p-ERK的积分光密度分别为31.49±3.66和30.62±2.90，p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为19975.52±1718.97和18513.65±1591.89，p-ERK的阳性细胞总面积分别为15310.05±618.57和14944.25±545.41，LIP+BI组与BI组相比均有显著性差异(P＜0.01)。DMTU250+LIP+BI组、DMTU500+LIP+BI组和 DMTU750+LIP+BI组海马CA1区p-p38 MAPK与p-ERK阳性表达均有明显的下降，胞核着色且较浅，p-p38 MAPK的积分光密度分别为48.19±4.50、36.32±3.03和35.29±3.18，p-ERK的积分光密度分别为22.60±2.23、13.27±2.01和13.48±2.18，p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为12924.70±1231.43、9604.63±1077.03和9388.41±989.71，p-ERK的阳性细胞总面积分别为9562.06±355.64、6550.33±343.35和6687.39±235.33，与LIP+BI组相比均有统计学差异(P＜0.01);②Western blot结果显示，全脑缺血的sham组、BI组和DMTU500+sham组大鼠海马CA1区p-p38MAPK和p-ERK的表达量较低，p-p38 MAPK的IOD值与对应β-actin的IOD值的比值分别为0.24±0.04、0.27±0.04和0.27±0.03，p-ERK的IOD值与对应β-actin的IOD值的比值分别为0.35±0.06、0.43±0.08和0.36±0.04。LIP+BI组和DMTU0+LIP+BI组海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK的表达量明显升高，p-p38 MAPK的IOD值与对应β-actin的IOD值的比值分别为0.67±0.08和0.68±0.08，p-ERK的IOD值与对应β-actin的IOD值的比值分别为0.83±0.07和0.84±0.07，LIP+BI组与BI组相比有显著统计学差异(P＜0.01)。DMTU250+LIP+BI组、DMTU500+LIP+BI组和DMTU750+LIP+BI组海马CA1区p-p38MAPK和p-ERK的表达量均明显下降，与LIP+BI组相比有统计学差异(P＜0.01)。上述免疫组化、Western blot结果表明，LIP部分通过自由基上调了脑缺血大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK的表达。　　2.2腺苷A1受体拮抗剂DPCPX对LIP诱导的大鼠海马CA1区p38 MAPK和ERK表达的影响　　动物分组同1.2　　实验方法同2.1　　实验结果:①免疫组化结果显示:全脑缺血的sham组、BI组和DPCPX32+sham组大鼠海马CA1区p-p38MAPK与p-ERK阳性表达较少，阳性细胞胞核着色且较浅，呈棕黄色，p-p38MAPK的积分光密度分别为12.23±1.52、12.42±1.81和12.96±1.09，p-ERK的积分光密度分别为4.60±0.19、4.75±0.23和4.63±0.19，p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为5366.53±926.59、5783.77±874.26和5850.75±722.59，p-ERK的阳性细胞总面积分别为3395.34±291.14、3453.57±374.73和3322.09±291.01。LIP+BI组、DPCPX0+LIP+BI组大鼠海马CA1区p-p38 MAPK与p-ERK阳性表达明显增多，胞核深染，呈深棕黄色，p-p38 MAPK的积分光密度分别为68.57±6.87和65.67±5.69，p-ERK的积分光密度分别为31.49±3.66和30.88±2.43，p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为19975.52±1718.97和18239.42±1594.06，p-ERK的阳性细胞总面积分别为15310.05±618.57和16071.61±689.89，LIP+BI组与BI组相比有显著统计学差异(P＜0.01)。DPCPX16+LIP+BI组、DPCPX32+LIP+BI组、DPCPX48+LIP+BI组海马CA1区p-p38 MAPK与p-ERK阳性表达均有明显的下降，胞核着色且较浅，p-p38 MAPK的积分光密度分别为38.74±4.02、28.05±2.71和27.40±2.20，p-ERK的积分光密度分别为23.49±1.84、16.24±1.32和16.88±1.43，p-p38 MAPK的阳性细胞总面积分别为12340.18±1056.76、8963.94±935.41和9396.58±850.62，p-ERK的阳性细胞总面积分别为9417.67±345.75、7826.61±233.91和8013.11±252.23，与LIP+BI组相比均有统计学差异(P＜0.01);②Western blot结果中各组p-p38 MAPK与p-ERK表达趋势与免疫组化结果一致。上述结果表明，LIP部分通过腺苷上调脑缺血大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和p-ERK的表达。　　2.3腺苷对脑缺血大鼠海马CA1区p38 MAPK和ERK表达的影响　　动物分组同1.3　　实验方法同2.1　　实验结果:①免疫组化结果显示:全脑缺血的sham组、BI组、Ade0+BI组和Ade20+sham组大鼠海马CA1区p-p38 MAPK与p-ERK阳性表达较少，阳性细胞胞核着色且较浅，呈棕黄色，p-p38 MAPK的积分光密度分别为12.23±1.52、12.42±1.81、13.02±1.18和14.54±1.34，p-ERK的积分光密度分别为4.60±0.19、4.75±0.23、4.66±0.20和4.59±0.31，p-p38MAPK的阳性细胞总面积分别为5366.53±926.59、5783.77±874.26、5529.65±766.16和5272.40±742.64，p-ERK的阳性细胞总面积分别为3395.34±291.14、3453.57±374.73、3635.09±255.83和3486.83±310.10。Ade10+BI组、Ade20+BI组和Ade40+BI组海马CA1区p-p38MAPK与p-ERK阳性表达均有明显增多，胞核深染，呈深棕黄色，p-p38MAPK积分光密度分别为23.09±1.46、41.61±3.22和39.57±5.02，p-ERK的积分光密度分别为12.61±1.67、25.60±2.06和24.54±1.59，p-p38 MAPK阳性细胞总面积分别为9078.42±909.58、14711.33±1226.75和14549.98±1129.92，p-ERK的阳性细胞总面积分别为8551.07±368.26、13350.40±651.58和12869.38±734.89，与BI组相比均有统计学差异(P＜0.01);②Western blot结果显示，全脑缺血的sham组、BI组、Ade0+BI组和Ade20+sham组大鼠海马CA1区p-p38和p-ERK的表达量较低。Ade10+BI组、Ade20+BI组和Ade40+BI组CA1区p-p38和p-ERK的表达量有较明显升高，与BI组相比均有统计学差异(P＜0.01)。上述结果表明，腺苷可模拟LIP的作用，上调海马CA1区p38 MAPK和ERK的表达。　　结论:　　(1) LIP前经股静脉给予自由基清除剂或腺苷A1受体拮抗剂可部分逆转LIP的脑保护作用，经股静脉给予腺苷可部分模拟LIP的脑保护作用，提示体液因子自由基及腺苷参与了LIP的脑保护作用。　　(2) LIP前经股静脉给予自由基清除剂或腺苷A1受体拮抗剂可部分阻断LIP对脑缺血大鼠海马CA1区p38 MAPK和ERK表达的上调作用，经股静脉给予腺苷可上调全脑缺血大鼠海马CA1区p38MAPK和ERK的表达，提示LIP可通过体液因子自由基及腺苷上调p38 MAPK和ERK的表达。